对克百威具高度特异性的免疫分析技术研究

合成了保留氨基甲酸酯结构的克百威半抗原,并采用活性酯法与载体蛋白质共价连接制备突出克百威分子结构特征的合成抗原。以合成抗原免疫新西兰白兔获得对克百威具高亲合力的抗血清,采用硫酸铵盐析和ＤＥＡＥ纤维素反相吸附法分离和纯化抗体。以辣根过氧化物酶采用改良的过碘酸钠法标记抗体、混合酸酐法标记半抗原。在此基础上分别建立了对克百威具高度特异性的间接竞争,包被抗原、包被抗体直接竞争酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）     

氯黄隆酶联免疫吸附分析技术研究

对邻氯苯磺酰胺进行衍生合成半抗原,并与载体蛋白质共价偶联制备突出氯黄隆分子特异性部分的合成抗原,以合成抗原免疫兔获得对氯黄隆具高亲合力的抗血清。采用硫酸铵盐析和ＤＥＡＥ纤维素反相吸附法分离纯化抗体,用辣根过氧化物酶以改良的过碘酶钠法标记 混合酸酐法标记半抗原。在此基础上建立了对氯黄隆具高度特异性的同接竞争,包被抗体,包被抗原直接竞争酶联免疫吸附分析技术。在优化条件下,氯黄隆测定的线性浓度范围为１０＾０－１０＾３ｎｇ／ｍＬ,检出限〈０．１ｎｇ／ｍＬ。邻氯苯磺酰胺及与氯黄隆结构类似的常用磺酰脲类除草剂不干扰氯黄隆的分析。     

硫代磷酸二乙酯类农药半抗原设计及抗体识别特性

通过分析硫代磷酸二乙酯类农药的结构特点, 设计并合成了系列半抗原; 采用活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了系列免疫原和包被原; 通过免疫新西兰大白兔获得了相应抗硫代磷酸二乙酯类农药的类特异性抗体. 建立检测硫代磷酸二乙酯类农药的间接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法, 分析探讨了免疫半抗原结构对抗体特性的影响, 并阐述了包被半抗原结构对ELISA灵敏度的影响规律. 结果表明, 手臂取代位置在苯环对位且手臂较短的免疫原具有较好的免疫效果, 同时异源包被可以显著提高ELISA方法的灵敏度. 由抗体PAb-H1和包被原H6-OVA建立的间接竞争ELISA方法可以同时检测7个广泛使用的有机磷农药, 其半抑制浓度(IC50)分别为蝇毒磷(0.013 mg/L)、对硫磷(0.348 mg/L)、喹硫磷(0.022 mg/L)、三唑磷(0.035 mg/L)、甲拌磷(0.751 mg/L)、除线磷(0.850 mg/L)及辛硫磷(1.301 mg/L), 最低检测限符合国内外相关有机磷药物最大允许残留限量标准(MRLS)的检测要求.     

对克伦特罗具有高特异性的酶联免疫吸附分析法研究

合成了克伦特罗(CL)半抗原2-(1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)-2-(叔丁胺基)乙氧基)乙酸,采用活性酯法将半抗原与牛血清白蛋白偶联合成免疫原,经免疫、分离、纯化获得抗CL多克隆抗体,建立了对CL具高特异性的直接竞争酶联免疫吸附分析(dc-ELISA)法。本方法对CL检测的线性浓度范围为1.0×10!4～1.0 mg/L,定量检测下限为0.13μg/L。在尿样中添加CL标准至含量分别为10.0和1.0μg/L,dc-ELISA法检测的回收率分别为90.0%～115.9%和80.5%～112.4%;相对标准偏差(RSD)分别为7.1%和12.6%(n=10)。特异性实验结果表明:抗体与CL结构类似物沙丁胺醇(SAL)的交叉反应率<0.3%,因此本研究所制备的抗体可有效避免现有克伦特罗ELISA试剂盒、胶体金检测试纸假阳性率高的问题。     

三唑磷的免疫分析技术研究

将合成的三唑磷半抗原采用活性酯法分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白共价偶联制备突出三唑磷分子结构特征的人工抗原与包被抗原。以人工抗原免疫新西兰白兔获得抗血清,采用硫酸铵分步盐析和DEAE纤维素反相吸附法从抗血清中分离纯化对三唑磷具特异性亲合力的抗体,以辣根过氧化物酶采用混合酸酐法标记半抗原。在此基础上,首次成功建立了对三唑磷具高特异性的间接竞争、包被抗体直接竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）技术。在优化条件下,三唑磷测定的线性浓度范围为0．001～1．0mg／L,检出限0．11μg/L,其他类似结构的常用有机磷酸酯类杀虫剂和苯唑醇不干扰三唑磷的测定。     

二甲氧基硫代磷酸酯类农药多残留免疫分析方法研究

以二甲氧基硫代磷酸酯类农药为目标,设计合成了系列半抗原及抗原,制备了4种宽谱特异性抗体。研究结果表明,含不饱和烷烃手臂的半抗原所制备的抗体宽谱特异性优于含酰胺键手臂的半抗原所制备的抗体。采用目标待测物的特征次级结构作为包被半抗原可显著提高ELISA检测灵敏度。经条件优化建立的最佳间接竞争ELISA多残留检测方法可同时检测8种常用高毒农药,其检出限(LOD)在2.6～104μg/kg之间,符合相关限量标准要求。生菜样品药物添加平均回收率为73.9%～121.4%;平均相对标准偏差为10.6%～18.4%。菜心样品药物添加平均回收率为80.4%～121.2%;平均相对标准偏差为13.5%～24.4%。方法精密度均达到气相色谱法的检测水平。     

直接竞争酶联免疫吸附分析法测定氰戊菊酯

采用活性酯法,将氰戊菊酯半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]-4-氨基丁酸与载体蛋白共价偶联合成突出氰戊菊酯分子结构特征的人工抗原和包被原.以人工抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,采用(NH4)2SO4分步盐析和DEAE纤维素柱层析法从抗血清中分离纯化对氰戊菊酯具特异性亲和力的抗体,采用活性酯法,以辣根过氧化物酶标记半抗原N-[2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰基]-6-氨基己酸.采用固定抗体、氰戊菊酯和酶标半抗原直接竞争结合固相抗体的模式, 建立对氰戊菊酯具高特异性的酶联免疫吸附分析方法.在优化条件下, 测定氰戊菊酯标样检测的线性浓度范围为0.001～10.0 mg/L; 检出限0.001 mg/L; 相对标准偏差(RSD, n=5)为9.19%.小白菜中分别添加0.10和5.0 mg/kg氰戊菊酯,直接竞争酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定,重复6次,回收率分别为83.8%～109%和93.6%～110%; RSD分别为11.7%和7.25%.对实际样品的有效检出限为0.007 mg/L.其它常用拟除虫菊酯类杀虫剂(氯氰菊酯、溴氰菊脂、功夫菊酯、醚菊酯、联苯菊酯)不干扰氰戊菊酯的测定.     

β-环糊精固载硅胶薄层色谱法拆分盐酸克伦特罗对映体

以羧甲基纤维素钠为交联剂,将β-环糊精固载在硅胶GF254表面上,并用其制备薄层色谱板。使用该薄层板拆分了盐酸克伦特罗对映异构体。考察了薄层拆分中展开剂的影响,发现展开剂中醇的种类和比例对拆分效果有较大的影响。分别考察了10种醇与乙腈混合溶剂作展开剂对拆分的影响,结果显示,只有正丁醇-乙腈、仲丁醇-乙腈、叔丁醇-乙腈混合溶剂作展开剂可拆分盐酸克伦特罗对映体。薄层色谱法拆分盐酸克伦特罗对映体的条件为：以1.00 g β-环糊精固载在15.00 g硅胶GF254表面上,并用其制备薄层板,以乙腈-仲丁醇(体积比为20∶80)混合溶剂作展开剂,于室温下展开。在此条件下,盐酸克伦特罗对映体单体在薄层色谱板上的比移值Rf分别为0.34和0.72,分离度Rs为4.09,实现了基线分离,而且样品在薄层色谱板上的斑点大小一致,拆分效果最好。     

板式磁颗粒化学发光免疫分析在癌胚抗原测定中的应用

开发了一种板式磁颗粒化学发光免疫分析方法并将其用于人血清中癌胚抗原(CEA)的测定,该方法利用HRP标记的CEA抗体以及FITC标记的CEA抗体与CEA抗原在微孔板中进行夹心反应,使用抗FITC抗体包被的磁性微粒子溶液作为分离固相,利用了一个特殊的适用于微孔板的磁性分离器进行分离,最后加入鲁米诺和H2O2底物进行发光反应.该方法采用微孔板代替透明管作为反应容器,磁颗粒作为分离固相在微孔里与免疫试剂反应,提前用BSA将微孔板封闭,很好地解决了管式磁颗粒方法非特异吸附高以及包被板方法线性范围小的局限性,同时避免了管间差异以及包被不均问题.该方法结合了微孔板作为反应容器以及磁颗粒分离体系的优点,使用夹心法对人血清中的CEA在0～250ng/mL浓度范围进行了测定,检测灵敏度为0.57ng/mL,批内和批间变异分别小于7%和11%.与市售CLIA试剂盒测定结果做了比对,两者显示了很好的相关性.该法经济、优越,有望实现商品化.     

呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法

本研究针对呋喃唑酮代谢物(AOZ),设计合成了系列半抗原,进一步通过偶联牛血清白蛋白(BSA)免疫Balb/c小鼠、细胞融合、筛选和亚克隆等过程成功获得了源于新颖半抗原H3的具有高亲和力(亲和力常数6.68× 1010L/mol)和高特异性(与其它功能类似物交叉反应小于0.1％)抗AOZ单克隆抗体.同时,基于设计合成的系列同/异源半抗原/包被抗原,考察了不同结构包被原对ELISA方法灵敏度的影响.另外,采用最佳的特征结构异源包被原H5 -OVA,建立了以对硝基苯甲醛(p-NP)为衍生剂的AOZ间接竞争ELISA(icELISA)和直接竞争ELISA(deELISA)检测方法.结果表明:icELISA模式的AOZ检测IC50为0.503 μg/L,定量检测线性范围(IC20～IG80)为0.06～14.0 μg/L,检出限(IC10)达0.017 μg/L; dcELISA模式的AOZ检测IC50为1.19 μg/L,定量检测线性范围为0.14～23.6 μg/L,检出限为0.056 μg/L.两种方法对AOZ的检测灵敏度和定量线性范围均达到相关检测限量要求,可满足不同需求的实际样品检测.     

用于免疫分析的聚苯乙烯微孔板功能化研究

为满足固相时间分辨荧光免疫分析研究需要,将聚苯乙烯微孔板内表面固相功能化,研制一种在聚苯乙烯微孔板内表面形成耐受强酸、强碱、有机溶剂的尼龙6膜层,并在膜层表面烷基化得到活性基团与己二酸二酰肼进行"手臂"连接,用双功能团戊二醛活化.检测结果表明,经修饰的聚苯乙烯微孔板化学连接蛋白质结合率比物理吸附高出5～10倍,在-4℃环境中存放6个月活性降低小于15%.灵敏度和稳定性显著提高.     

聚苯乙烯免疫检测球珠的表层改性及其性能

<正> 随着免疫检测在生物医学研究及临床诊断中的发展和应用,七十年代后期由高聚物制成的乳胶或球珠作为免疫载体亦得到较快的发展;八十年代以来有多种产品问世,其中聚苯乙烯球珠及检测板、盒国外已有专厂生产。 由于聚苯乙烯球珠对免疫体、酶等的固定系物理吸附,在制备及检测过程中,这些蛋     

小分子抗原人工合成进展

小分子免疫分析技术的应用日渐广泛,合成稳定的、具有良好免疫原性的人工抗原是制备单克隆抗体和建立免疫分析方法的前提和关键。 本文对国内外半抗原的设计与合成方法、载体的选择、半抗原与载体的耦联方法等进行了综述,并对小分子抗原人工合成中相关的问题进行了讨论。     

固相萃取-气相色谱-质谱分析肉样中盐酸克伦特罗的残留量

建立了固相萃取 气相色谱 质谱联机分析肉样中盐酸克伦特罗残留量的方法。对盐酸克伦特罗在C1 8和离子交换固相萃取柱上的保留行为进行了研究 ,发现不同浓度盐酸克伦特罗的固相萃取回收率在 75 %～ 95 %之间 ;肉样中的加标回收率在 70 %～ 83 % ;相对标准偏差在 4 .95 %～ 1 3 .4 % ;最低检出限为 1 μg kg。盐酸克伦特罗的硅烷化产物 ,采用选择离子的模式进行检测 ( 86、2 4 3、2 62、2 77) ,衍生物的峰面积与样品浓度在0 .0 0 2 5 2～ 2 .0 2mg L范围内呈良好的线性关系 ,线性回归系数大于 0 .9999。     

微孔板蛋白芯片可视化检测方法的研究

将微孔板生物芯片制备技术与银增强显色方法相结合,建立了一种高通量蛋白免疫分析新方法。研究采用夹心法反应原理,将人IgG捕获抗体以微阵列形式点样于96孔板底部制备成蛋白微阵列,并依次与人IgG、生物素标记二抗及链亲和素胶体金反应,最后用银增强法显色。采用平板式扫描仪对微孔板显色结果进行快速扫描成像,图像采用luxscan 3.0软件处理。结果表明:微孔板蛋白芯片的最低检测量可达0.6 ng/mL,线性范围10 ng/mL~100μg/mL,相关系数为0.98,重复性较好(CV10%)。     

醚型菊酯类农药通用抗原的合成及鉴定

以2-(4-乙氧基苯基)-2-甲基丙醇和氯乙酸钠为原料,合成了醚型菊酯类农药通用半抗原Hapten I,经1 H-NMR及13C-NMR鉴定后,分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制得免疫原和包被原,经紫外光谱分析法计算得其偶联比分别为14∶1和35∶1,说明人工抗原合成成功.免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,效价达1.28×105,用半抗原经间接竞争ELISA检测人工抗原的免疫原性,IC50和IC10值分别为0.2653和0.0012 mg/L,证明人工抗原具有较好的免疫原性.交叉反应表明此多克隆抗体具有良好的特异性.     

分子印迹电位型传感器快速检测猪尿液中的克伦特罗

以盐酸克伦特罗为模板分子,采用沉淀聚合法合成了克伦特罗的分子印迹聚合物,并以其为离子载体,制得分子印迹聚合物膜克伦特罗离子选择性电极。在最优实验条件下,电极对克伦特罗阳离子的检出限可达7.0×10-8mol/L,线性范围为1.0×10-7～1.0×10-4mol/L,能斯特斜率为55.7 mV/decade。此电极具有优越的选择性、快速的响应时间以及良好的稳定性;已成功应用于实际猪尿样品中克伦特罗的测定,加标回收率为98%～107%,检测时间小于3 min。     

鸡蛋中泰妙菌素化学发光酶免疫分析方法研究

针对鸡蛋中泰妙菌素的残留问题,通过半抗原及抗原设计合成、动物免疫及细胞融合筛选,成功得到可特异、灵敏识别泰妙菌素的单克隆抗体,并建立了泰妙菌素的化学发光酶免疫分析方法(CLEIA).采用棋盘法结合单因素实验优化策略,确定最佳反应条件为:包被原质量浓度0.26μg/mL,抗体质量浓度0.94μg/mL,反应体系为0.02...     

基于核酸适配子识别的荧光法检测可卡因

基于荧光标记和核酸适配子识别可卡因,建立了简单、灵敏的可卡因新型荧光分析法.在微孔板表面组装亲和素-生物素化可卡因适配子-FAM标记可卡因适配子互补短链复合物,根据加入可卡因前后荧光强度的变化来定量可卡因.实验考察了微孔板包被亲和素浓度、生物素标记适配子用量、FAM标记可卡因适配子互补短链用量、反应温度、反应时间等因素...     

多壁碳纳米管-分子印迹传感器测定盐酸克伦特罗

结合碳纳米材料和分子印迹技术,建立了以K3[Fe(CN)6]为探针测定盐酸克伦特罗的方法。以邻苯二胺为功能单体,盐酸克伦特罗为模板,采用电化学聚合法在多壁碳纳米管修饰电极表面制备了分子印迹薄膜。用乙腈水溶液可快速去除模板,得到多壁碳纳米管-分子印迹传感器。用循环伏安法、交流阻抗法和石英晶体微天平技术对印迹膜进行了表征,膜厚为12.3 nm。K3[Fe(CN)6]的相对峰电流与盐酸克伦特罗的浓度在4.0×10-8～6.6×10-6 mol/L范围内呈线性关系,检测限为8.1×10-9 mol/L。选择性实验表明传感器对结构类似物具有较强的抗干扰能力。此传感器可用于猪肉中盐酸克伦特罗的测定,加标回收率为101.3%～107.9%。