二维液相色谱切换技术及其应用

多维液相色谱已成为复杂样品研究的重要工具。本文在介绍多维液相色谱原理与方法的基础上,重点讨论了二维液相色谱接口切换技术的近期发展,并对其应用现状进行了总结分析。     

IEX/RP二维液相色谱中弱保留组分收集模式的构建及系统评价

以十通阀和捕集柱接口形式,构建了弱阴离子交换/反相(WAX/RP)二维液相色谱分离系统.通过将第一维离子交换色谱分析中的前部集中洗脱出的弱保留组分收集后单独分析,剩余样品进一步采用二维液相色谱分析,可以有效避免第二维色谱柱对特殊样品局部集中流出导致的第二维分离超柱容量问题,提高了系统的整体分离能力.使用4种蛋白胰蛋白酶酶解后的多肽样品评价该系统,在不分流的系统中共检测到115个峰.对第一维分离的前15 min分流后得到的组分单独分析,共识别出58个峰,后续的二维分离中共得到78个峰.2种方法相比,第二种方法检测峰数增加了21个,一些低丰度的组分在弱保留组分收集后被识别.     

二维液相色谱接口技术

二维液相色谱具有峰容量大、分辨率高、分析速度快等优点,已经成为复杂样品分离分析的重要工具。两种分离模式的转换通常需要经过一个特殊接口来完成,接口是二维液相色谱系统的核心,也是限制二维液相色谱应用的瓶颈;两种流动相不互溶时,接口尤为重要。本文针对二维液相色谱接口技术近期的发展和应用进行总结。引用文献51篇。     

二维液相色谱阀切换接口技术的发展及应用

在复杂样本分析中,一种分离模式往往不能提供足够的分离度,组合不同的分离模式构建二维液相色谱系统是解决这一问题的有效途径。阀切换接口是二维液相色谱柱切换技术的核心,接口技术影响系统的分离度和灵敏度。传统的接口技术在生物、药学、食品、环境等领域得到了广泛应用,近20年发展了众多新型的接口技术来解决二维液相色谱中正交组合溶剂不兼容问题。本文综述了柱切换接口技术的原理和应用,并总结了近5年利用柱切换二维液相分析技术的进展,期望为二维液相色谱技术的发展和应用提供借鉴。     

二维液相色谱接口的改进及其在蛋白质组学研究中的应用

随着蛋白质组学、本草物质组学等组学概念的提出,所需分析的样品的成分越来越复杂,因此具有强大分离能力的多维液相色谱技术受到人们越来越多的关注。二维液相色谱中第二维的分离性能和速度是整个分离系统性能的关键。基于捕集柱模式,我们采用经特殊设计的流路系统,使得双捕集柱型接口具有预分离的功能。样品从第一维流出以后被富集在捕集柱1的柱头,经过脱盐后,正冲捕集柱,捕集柱1与第二维色谱柱联用对富集的样品进行分离,增加了第二维分离效率。当捕集柱上的样品全部被洗脱到第二维色谱柱上时,捕集柱2已经完成对第一维洗脱液中样品的捕集和脱盐,此时将阀进行切换,捕集柱2与第二维色谱柱直接相连进行洗脱。循环切换捕集柱1和捕集柱2,维持较高的阀切换频率,实现了第二维色谱柱的连续洗脱。因此保证了第二维分离具有较快速度,同时具有较高的分离效率。使用35 mm长捕集柱和十通阀为接口,以弱阴离子交换(WAX)色谱为第一维分离模式,以反相(RP)色谱为第二维分离模式,构建了WAX-RP二维液相色谱系统(2D-LC system)。以小鼠血清为样品对系统进行了初步评价。色谱流出曲线出现了明显的界面现象,这是由于捕集柱流动相中含有的较多盐分流出时的背景吸收造成的。同时,由于界面两侧的流动相黏度不同产生了黏性指进(VF)现象。当第二维色谱柱长度为50 mm时,理论上可将第二维分离效能提高70%。该接口可以应用于多种二维液相色谱模式,适用于蛋白质组学和本草物质组学研究中对于复杂样品的分离分析。     

正相模式/反相模式的二维液相色谱系统的构建与应用

以4.6mm×50 mm i. d.的Hypersil SiO2正相色谱柱为第一维,4.6mm×250 mm i. d.的Kromasil C18反相色谱柱为第二维,通过升高第二维色谱温度的方法增加两维流动相间互溶性的方法构建了定量环-阀切换接口的二维液相色谱系统(NPLC×RPLC)。根据有机溶剂的特征,在第一维正相色谱流动相中加入二氧六环;第二维反相色谱流动相中加入异丙醇,在改善流动相兼容性的同时,有效调整分离选择性。采用此系统对正天丸样品进行分离分析,达到1120的峰容量。     

高温二维液相色谱系统的构建及其评价

在二维液相色谱中, 第二维的分离速度是制约其发展的重要因素. 升高色谱柱温度可以有效降低流动相粘度, 加快溶质在两相间的传质速率, 有效加快分析速度. 以离子交换色谱法(WAX)为第一维分离模式和反相色谱法(RP)为第二维分离模式, 十通阀和两个捕集柱为接口, 通过将第二维色谱柱温度升高到80 ℃和提高流量到3 mL/min, 构建了高温WAX/RP二维液相色谱系统. 以4种标准蛋白的酶解物为样品评价系统的分离性能, 第一维共有33个馏分被捕集并导入到第二维分析, 高温二维液相色谱系统识别出187个色谱峰.     

全二维液相色谱(IEC/RP)的构建与评价

以IEC/RP模式构建了二维液相色谱系统,采用平行交替柱捕集分析的2位十通切换阀作接口,第一维洗脱产物按10:1的分流比分流后,得到IEC和RP切换谱图.以5个标准蛋白混合物的分离评价该系统,在单独一维模式中不能分离的样品在全二维液相色谱中得到了很好的分离.     

基于捕集柱阵列的制备型二维液相色谱纯化烟草中的4个组分

二维液相色谱(2D-LC)因具有较高的峰容量,在复杂样品的分离分析中获得了广泛的关注。然而,制备型2D-LC以纯化高纯单体为目标,在方法开发和设备构成等方面与分析型2D-LC有较大的不同,目前尚未得到充分的开发,在大规模的制备纯化中应用较少。本文以一套制备液相色谱模块为分离系统,以稀释泵、切换阀和捕集柱阵列为接口,构建了新型的制备型2D-LC系统,旨在规模化纯化多个活性成分。以烟叶中可以用作医药原料的烟碱、绿原酸、芦丁和茄尼醇等组分为目标物,考察了不同类型填料对样品的捕集效率、过载条件下的色谱保留行为等,优化了制备色谱条件。进而利用在线2D-LC系统实现了烟叶提取物的纯化,通过一次运行获得了4个高纯化合物。该系统具有中压色谱纯化成本低、系统在线运行自动化程度高、稳定性好及容易放大等优点。烟叶中活性化学成分的回收利用对促进烟草行业的发展及带动地方农业经济开发具有重大的意义。     

毛细管高效液相色谱-毛细管电泳二维分离接口的优化

对毛细管高效液相色谱－毛细管电泳二维分离的动态脉冲接触式接口系统进行了最优化研究。讨论了它的设计原理,优化了操作条件,并对其性能进行了评价。利用这种接口,使样品在第二维的进样浓度达到第一维流出浓度的８１％,１００次连续进样峰高及迁移时间的ＲＳＤ平均值分别为３．０％、１．８％,进样时间也得以缩短,并对甘草的水提取物实现了高效二维分离。,     

高温正相色谱/反相色谱(HTNPLC/RPLC)二维联用系统的构建与应用

为解决含水正相色谱与反相色谱联用过程中的谱带展宽问题,以高温正相色谱(HTNPLC)为第一维,室温反相色谱(RPLC)为第二维,分别建立了切割模式的二维液相色谱(HTNPLC-μRPLC)和全二维液相色谱(HTNPLC×RPLC)系统.样品首先在第一维(CN色谱柱)进行正相分离,第一维洗脱产物选择性地或者交替存储在十通阀上的定量环中,然后切换十通阀将定量环内存储的样品组分转移到第二维(C18色谱柱)进行反相分离.该系统降低了第一维切割组分在第二维柱头的扩散,提高了分离度以及分离效率.采用多环芳烃混合物和天然植物甘草提取液对该二维液相色谱系统进行了评价.     

去除血浆中高丰度蛋白质的二维液相色谱体系的建立

血浆中高丰度蛋白质的存在严重干扰低丰度蛋白质的检测,是困扰血浆蛋白质组学研究的技术瓶颈之一。针对这一热点问题,建立了一种二维液相色谱(强阴离子交换色谱-反相高效液相色谱)分离系统,对血浆中的高丰度蛋白质进行了色谱定位并进行去除。选择TSKgel SuperQ-5PW为第一维色谱分离柱,第二维色谱分离采用Jupiter C4柱,对第一维的馏分进行进一步的分离。通过梯度优化,血浆样品经过二维系统得到充分分离。第二维分离过程中从紫外信号强度高(215 nm,大于20 mAU)的峰中选择10个峰,利用液相色谱-串联质谱鉴定出32种高丰度蛋白质,包括人血清白蛋白、免疫球蛋白G等高丰度蛋白质。该体系为血浆中更多高丰度蛋白质的去除以及血浆蛋白质组学的更深入研究提供了重要思路。     

六昧地黄丸组分的二维液相色谱分离

以1个常规六通阀直接连接两支常规尺寸的色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.),构建简单的SCX/RP在线二维液相色谱系统,对中成药六味地黄丸组分进行了优化分离.样品经过第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX),洗脱产物分离后通过六通阀直接富集到反相分析柱(C18)顶端,被转移到第二维色谱柱上继续进行分离.经过11步不连续的线性梯度洗脱,二维分离系统出峰数量达到550多个,峰容量达到2266.构建的二维液相色谱系统结构简单,与一维色谱相比,具有分辨率高、峰容量大的特点.     

六味地黄丸组分的二维液相色谱分离

以1个常规六通阀直接连接两支常规尺寸的色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.),构建简单的SCX/RP在线二维液相色谱系统,对中成药六味地黄丸组分进行了优化分离。样品经过第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX),洗脱产物分离后通过六通阀直接富集到反相分析柱(C18)顶端,被转移到第二维色谱柱上继续进行分离。经过11步不连续的线性梯度洗脱,二维分离系统出峰数量达到550多个,峰容量达到2266。构建的二维液相色谱系统结构简单,与一维色谱相比,具有分辨率高、峰容量大的特点。     

离线二维反相液相色谱/超临界流体色谱在瓜蒌子分离中的应用

发展了离线二维反相液相色谱/超临界流体色谱(2D RPLC/SFC)分离瓜蒌子的方法。实验在第一维采用反相色谱,按色谱峰收集从瓜蒌子样品中制备得到的12个组分(F_1~F_(12)),并将得到的组分在第二维使用SFC分离。这些组分在RPLC和SFC的分离对比说明,该二维方法具有良好的分离正交性,可至少检测到150个色谱峰,对于解决结构相似物质的分离、微量成分的富集表现出了明显的优势。SFC方法采用了乙醇-正己烷(3∶7,v/v)的混合溶剂作为改性剂,既提供了适当的洗脱能力,也保证了在上样量增加时满足样品溶解的要求。此二维分离体系可放大到制备水平用于化合物的制备,为瓜蒌子化学成分的纯化制备提供技术支持,为其物质基础研究提供参考。     

新型全二维微柱液相色谱分离平台的构建

采用自动进样器和一套二元梯度泵构建了以阳离子交换色谱-反相色谱(SCX-RPLC)为分离模式的新型全二维微柱液相色谱分离平台.在第一维分离中,通过自动进样器将不同浓度的盐溶液以台阶梯度输送至SCX柱上,实现肽段的分级洗脱.洗脱下的肽段经C8预柱富集、除盐后,进入第二维C18 RPLC柱上,通过线性梯度实现进一步的分离.采用该平台分离了5种标准蛋白的酶解产物,系统峰容量可达1 467.结果表明,该平台可以自动完成进样、除盐、分离及检测.     

二维液相色谱分离及鉴定滁菊中的多酚类化合物

将Lichrospher diol-5亲水柱和Cortecs C18+反相柱组合,构建了亲水/反相二维液相色谱系统(HILIC/RPLC),理论峰容量为1 117。采用表面积覆盖法定量计算该系统分离多酚类化合物的正交性指数SCG为0.56,表明二维柱系统有着良好的峰分辨率和正交性。利用该系统对滁菊样品甲醇提取液中的多酚进行分离和鉴定,在二维空间中分离得到23个物质的色谱峰,通过对比标准样品和滁菊样品的保留时间和紫外吸收光谱,鉴定出13种多酚类物质,包括芹菜素、香叶木素、金合欢素、金合欢素-7-O-葡糖苷、绿原酸、异鼠李素-3-O-葡糖苷、香叶木素-7-O-葡糖苷、金合欢素-7-O-芸香苷、圣草酚-7-O-葡糖苷、槲皮素苷、异绿原酸A、异绿原酸B、芹菜苷。首次发现滁菊中含有异鼠李素-3-O-葡糖苷、金合欢素-7-O-芸香苷、圣草酚-7-O-葡糖苷、芹菜苷等多酚类化合物。其中,异鼠李素-3-O-葡糖苷首次发现存在于菊属植物中。     

新型微填充柱－毛细管柱二维色谱系统过程的动力学研究

从色谱动力学角度对新型微填充柱－毛细管柱二维色谱系统过程中双柱条件与流出曲线及柱效之间的依赖关系加以系统研究。结果表明：由于双柱条件之间存在关联，双柱系统流出曲线特征与单柱系统存在一定的差异，流出曲线一阶矩和二、三阶中心矩以及双柱系统的柱效皆由预柱和主柱条件综合确定。     

新型微填充柱－毛细管柱二维色谱系统过程的动力学研究

 从色谱动力学角度对新型微填充柱－毛细管柱二维色谱系统过程中双柱条件与流出曲线及柱效之间的依赖关系加以系统研究。结果表明：由于双柱条件之间存在关联，双柱系统流出曲线特征与单柱系统存在一定的差异，流出曲线一阶矩和二、三阶中心矩以及双柱系统的柱效皆由预柱和主柱条件综合确定。