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蛋白质聚集现象是生物制药行业面临的重大问题之一,对蛋白质药物有效性、安全性、质量可控性有很大影响。体积排阻色谱技术是蛋白质药物及其聚集体检测分析的标准技术,具有操作简单、分离条件温和、基本不破坏蛋白质药物结构等优点。但由于蛋白质与固定相存在非特异性相互作用,采用该法检测时存在洗脱延迟、色谱峰拖尾、基线漂移、蛋白质回收率低等问题。该文介绍了体积排阻色谱的分离原理及实际应用,并对该技术在蛋白质药物检测中存在的非特异性吸附问题及相关方法优化做了简要概述。同时列举了几种与体积排阻色谱互补的可用于蛋白质药物聚集体分析的技术。最后,对体积排阻色谱技术的发展前景进行了展望。 相似文献
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利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的变性 总被引:2,自引:0,他引:2
通过比较蛋白质变性时的色谱行为和生物物理特性,提出利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质变性时的构象变化,根据色谱参数中保留时间,比较蛋白质变性时体积的相对变化,利用色谱峰数,确定形成变体的数目,根据峰形和峰数的变化,描述蛋白质的伸展程度,利用不同波长下峰高的变化,推断蛋白质变性芳香族基酸残基的暴露情况,利用建立的尺寸排阻色谱观察了液体和固液α-淀粉酶在低温下放置时的变性情况,讨论了变性时间和变性温度对蛋白 相似文献
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<正>本文对近期色谱-质谱相关技术和方法学研究进展进行简略评述。由于色谱方法研究和应用领域十分广泛,涉及方方面面,本文仅简要介绍色谱、多维色谱及其与质谱联用技术在生物物质分析领域(主要是人类染色体蛋白质组、糖蛋白、磷酸化蛋白质组)的研究工作,此外还包括体积排阻色谱分离病毒颗粒、量子点、肝素方面的研究和多维气相色谱分析进展及其他亮点文章。 相似文献
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采用变性和非变性电泳、 高效凝胶排阻色谱、 内源荧光发射光谱和荧光相图以及生物活性测定等方法, 研究了盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程及此过程中卵清溶菌酶分子各稳定构象态的分布和过渡. 结果表明, 当复性液中盐酸胍浓度分别约为5.0和2.4 mol/L时, 变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程各存在1个稳定折叠中间态, 重折叠过程符合"四态模型". 在卵清溶菌酶分子四态重折叠过程基础上, 结合盐酸胍与卵清溶菌酶分子之间的缔合-解离平衡, 给出了一个定量描述变性剂诱导的蛋白质分子复性过程中蛋白质分子复性率随溶液中变性剂浓度变化的方程. 该方程包含2个特征折叠参数, 一个是蛋白质分子从一个稳定构象态过渡到另一个稳定构象态的热力学过渡平衡常数k; 另一个是在此过程中平均每个蛋白质分子所结合的变性剂分子数目m. 通过这2个特征折叠参数能够定量描述盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶完全去折叠态、 折叠中间态和天然态分子随复性液中盐酸胍浓度变化的分布和过渡情况. 相似文献
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盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠过程的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
分别用内源荧光光谱法、荧光相图法、荧光探针法、荧光猝灭法、蛋白质电泳法以及体积排阻色谱法研究了盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程. 内源荧光光谱和荧光相图结果表明, 当变性液中盐酸胍浓度约为1.0 mol/L时, 芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程中出现一个部分折叠中间体, 其去折叠过程符合“三态模型”; 荧光探针结果表明, 在溶液中盐酸胍浓度约为1.0 mol/L时, 中间态芽孢杆菌a-淀粉酶分子中存在着能够与探针分子1-苯胺 基-8-萘磺酸(ANS)结合的稳定的疏水区域; 荧光猝灭研究给出了不同程度变性的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶中的Trp的分布情况, 结果表明中间态芽孢杆菌a-淀粉酶分子中能够被碘化钾猝灭的位于分子表面的色氨酸残基数目达到最大的8个; 蛋白电泳和体积排阻色谱结果表明, 在盐酸胍诱导的芽孢杆菌a-淀粉酶分子的整个去折叠过程中, 不会以共价键或非共价键形式形成芽孢杆菌a-淀粉酶分子之间的集聚体或集聚体沉淀. 在此基础上, 对盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程进行了描述. 相似文献
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自顶向下蛋白质组学的一个重要难题是缺乏与质谱可以在线连用并且可以提供高效蛋白质分离的液相分离技术。毛细管区带电泳与纳升反相色谱都可以与质谱在线连用,并且在复杂蛋白质样品分析方面也都有了显著的提升。在这里,我们首次比较了先进的纳升反相色谱-串联质谱与毛细管区带电泳-串联质谱平台用于自顶向下蛋白质组学分析。相对于纳升反相色谱-质谱而言,毛细管区带电泳-质谱可以将标准蛋白质样品的消耗量降低10倍,而且保持与纳升反相色谱-质谱相当的蛋白质信号强度。有意思的是,与毛细管区带电泳-质谱相比,纳升反相色谱-质谱可以获得更高的蛋白质分子的气相价态。这个现象可能是由于反相流动相中的高浓度乙腈使得蛋白质变性的更加充分。从1微克的大肠杆菌蛋白质样品中,毛细管区带电泳-串联质谱可以鉴定到159个蛋白质和513个蛋白质变体,而纳升反相色谱-串联质谱仅鉴定到105个蛋白质和277个蛋白质变体。当将大肠杆菌蛋白质的上样量提高到8微克时,纳升反相色谱-串联质谱可以鉴定到245个蛋白质和1004个蛋白质变体。由于纳升反相色谱-串联质谱具有比毛细管区带电泳-串联质谱更高的上样量与更宽的分离窗口,当蛋白质样品量不受限制时,纳升反相色谱-串联质谱具有明显的优势。但是,在痕量样品分析方面,毛细管区带电泳-串联质谱具有更大的潜力。 相似文献
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建立在蛋白质变性-复性三态模型的基础上, 给出了一个描述在变性液中变性蛋白质复性时蛋白质浓度和其复性率的关系式. 通过这个关系式, 可以获得两个重要的描述蛋白质变性-复性体系特征的参数, 一个是包含在一个集聚体分子中的变性蛋白质的分子数目n, 另一个是蛋白质从原始态到形成集聚体过程中的表观集聚平衡常数K. 以三种溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的变性-复性过程对此方程进行了验证, 结果表明所给出的方程能够很好地描述三种溶菌酶在这两种变性液中的复性结果, 三种溶菌酶在两种变性液中有形成二分子集聚体的趋势. 变性溶菌酶在复性过程中的电泳和高效凝胶排阻色谱也同时能够监测到复性过程中集聚体的形成, 并且监测结果与上述方程所得的结果一致. 相似文献
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采用分子排阻色谱和激发/多波段发射荧光检测器,结合三维荧光光谱和平行因子分析,研究了新、老填埋垃圾渗滤液中溶解性有机质( DOM)的组成。实验结果表明,两种渗滤液来源的DOM均含有类蛋白和类腐殖质物质。在新填埋垃圾渗滤液中,类蛋白物质有4种存在形态,包括大分子蛋白质形态、高/低分子量腐殖质结合态和多肽/氨基酸形态;在老填埋垃圾渗滤液DOM中,类蛋白物质只有两种形态,分别为大分子蛋白质形态和腐殖质结合态。相比于分子排阻色谱,三维荧光光谱结合平行因子分析能够分辨出腐殖质和非腐殖质结合态的类蛋白物质,但不能有效区分蛋白质和以多肽/氨基酸形态存在的类蛋白物质。结果表明,三维荧光光谱结合平行因子分析和分子排阻色谱,可以表征DOM中不同形态分布的类蛋白和类腐殖质物质。 相似文献
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利用紫外-可见光谱法、荧光相图法、荧光偏振法以及共振瑞利散射法多光谱技术对溶菌酶(Lysozyme)的变复性特征进行表征,分析溶菌酶变复性机理,构建其变性动力学模型.结果表明,变性过程溶菌酶分子体积变大,结构松弛,变性速度快,不存在中间态,符合"二态模型";复性过程变性溶菌酶分子体积变小,结构紧缩,复性过程慢,且存在中间体,符合"多态模型",说明了溶菌酶的复性过程比其变性过程复杂.实验定量研究了不同变复性条件下,溶菌酶不对称变复性机理,为溶菌酶分子结构分析的研究提供了参考. 相似文献
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液相色谱Z值对溶菌酶分子构象变化的定量表征 总被引:1,自引:0,他引:1
目前, 研究蛋白分子的构象变化用得最多的是光谱法, 如荧光光谱、圆二色谱和核磁共振谱等[1]. 由于蛋白质分子构象变化与其在色谱中的保留行为直接相关[2], 所以色谱法也成为研究蛋白质分子构象变化的一种新方法[3]. 此外, 计量置换理论中的Z值也已被成功地用于表征生物大分子的构象变化[4]. 用Z值研究蛋白质分子构象变化的优点是可以使用不纯的样品, 这是因为在测定Z值的过程中会与其它组分相分离. 使用Z值还会对蛋白分子构象变化进行定量表征[5,6]. 本文以溶菌酶(Lys)为目标蛋白, 用色谱法[反相液相色谱(RPLC)和弱阳离子交换色谱(WCX)]系统地研究了Lys在不同变性(胍变非还原、脲变非还原、胍变还原和脲变还原)环境中因疏水性及电荷分布的不同对Lys分子构象变化的影响, 并用Z值进行了定量表征. 相似文献
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电感耦合等离子体质谱间接法测定蛋白质含量 总被引:1,自引:0,他引:1
尺寸排阻色谱分离牛血清白蛋白(BSA),超氧化物歧化酶(SOD)和金属硫蛋白(MT)等3种标准蛋白的混合物后,在线使用电感耦合等离子体质谱测定这三种蛋白中的S,并根据每种蛋白质含有的S原子数,计算出3种蛋白质的相对含量。尺寸排阻色谱的流动相为0.1mol/LTris-HAc。向电感耦合等离子体质谱的六级杆加入反应气O2,使之与S反应生成SO ,间接测定32S16O 而避开直接测量32S时存在的严重干扰。测量结果与天平称量所得结果一致。方法的精密度好,每个蛋白质峰面积的RSD<3%(n=3)。BSA、SOD和MT的检出限分别为14、52和27pmol。 相似文献