基于叠氮基-氰基点击化学的苯硼酸亲和硅胶的制备及其在糖蛋白/糖肽选择性富集中的应用

硼亲和色谱法在糖肽/糖蛋白选择性富集中的应用趋于成熟。硼酸亲和材料的选择性，生物相容性，制备过程是否简便均是开发新型苯硼酸功能化材料需要考虑的问题。该研究立足硼酸亲和材料开发的关键问题，设计并开发了一种新型苯硼酸亲和硅胶（TCNBA）。该材料采用基于叠氮基-氰基的无铜催化点击化学方法进行合成，生物相容性好，制备方法简便。红外光谱和X射线光电子能谱图表征结果证明材料合成成功。TCNBA的糖肽富集选择性利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行评价，结果表明，TCNBA能够分别从辣根过氧化物酶（HRP）和免疫球蛋白G（IgG）酶解液中鉴定出13个和11个糖肽；以HRP和牛血清白蛋白（BSA）酶解液混合物（物质的量比1：10）作为研究对象，富集后能够鉴定出5个糖肽。TCNBA的糖蛋白富集选择性利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）进行评价，以HRP、IgG、核糖核酸酶B（RNaseB）作为考察对象，结果表明，TCNBA对糖蛋白具有较好的富集选择性。以实际样品人血清为测试对象验证TCNBA在实际生物样品中的应用价值。结果显示，富集后非糖蛋白得到较大程度去除，糖蛋白得以富集。所制备的材料和方法具有大规模实际蛋白质样品分离处理的应用前景。     

小尺度4-巯基苯硼酸修饰纳米金粒子用于大鼠肝脏糖蛋白选择性富集和质谱鉴定研究

报道了利用硼氢化钠还原一步法合成小尺度巯基苯硼酸修饰的纳米金材料（尺寸约为3 nm）,合成方法简便快捷.利用纳米金表面的硼酸基团与糖蛋白/糖肽中顺式邻二羟基的酯化反应,成功实现了糖肽和糖蛋白的选择性富集.利用该材料对糖蛋白HRP酶解产物进行富集,经富集后糖肽质谱峰的信号强度提高近百倍;将该材料用于大鼠肝脏中糖蛋白的富集...     

基于纳米粒子的糖蛋白/糖肽分离富集方法

蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,糖基化对蛋白质的结构和功能有着非常重要的影响。在血清或者组织提取液中,一些低浓度的糖蛋白/糖肽是具有高度临床灵敏性和特异性的生物标记物,这些生物分子可能对疾病发生机理探讨、疾病标记物发现及蛋白类新药开发提供重要信息。由于糖蛋白/糖肽的丰度低,从复杂的生物样品中高选择性富集糖蛋白/糖肽一直是糖蛋白组学的难点和重点。纳米结构的材料因其大比表面积、丰富的活性亲和位点和特殊结构,已经广泛应用于糖蛋白/糖肽的分离富集中。本文对基于金、SiO₂、TiO₂、Fe₃O₄、金刚石和聚合物纳米粒子为载体的糖蛋白/糖肽分离富集方法的研究进展作了简要概述,并且阐明了糖蛋白/糖肽分离富集方法所面临的挑战,最后,对其未来发展方向做了展望。     

葡萄糖-6-磷酸功能化亲水磁探针：有效分离富集糖肽/磷酸肽的双用途亲和材料

在Fe₃O₄磁芯上通过逐层修饰构建了葡萄糖-6-磷酸(G6P)功能化亲水磁探针Fe₃O₄@PDA@TiO₂@G6P. 聚多巴胺(PDA)可以作为偶联连接剂进一步接枝二氧化钛(TiO₂); 接枝的TiO₂除作为G6P的锚定位点外, 还 可通过金属氧化物亲和层析技术有效富集磷酸肽; G6P的官能化赋予了纳米球高亲水性的表面, 并利用亲水作用液相色谱法实现了糖肽的捕捉. 实验结果表明, 探针对糖肽具有低的检出限(0.1 fmol/μL)、 高的选择性 [m(HRP)∶m(BSA)=1∶1000]、 良好的重复性(10次循环)和高的负载量(300 mg/g); 对磷酸肽具有低的检出限(0.02 fmol/μL)和高的选择性[n(β-casein)∶n(BSA)=1∶1000). 此外, 这种双用途亲和材料具有同时富集糖肽和磷酸肽的能力,可从人唾液中鉴定出34个糖肽和36个磷酸肽, 表明其在多种翻译后修饰的蛋白质组学分析中具有巨大的应用前景.     

聚酰基氨基脲类多孔有机聚合物的制备及其在糖肽富集中的应用

通过均苯三甲酰肼(BTZ)和对苯二异氰酸酯(PDI)的聚合反应制备了一种新型的聚酰基氨基脲类多孔有机聚合物(POP)。采用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、交叉极化魔角自旋碳13核磁共振(CP-MAS13C NMR)、氮气物理吸附/脱附实验和水接触角等手段对POP-1的物理性质进行表征。其中比表面积为166 m~2/g,水接触角为46.4°,表明这种多孔材料具有良好的亲水性。因此,尝试将POP-1应用于标准蛋白质和复杂生物样品中糖肽的亲水色谱富集。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)分析,从500 fmol人血清免疫球蛋白G(IgG)酶解液中共鉴定到19条典型的N-连接糖肽;通过毛细管液相色谱-串联质谱(c LC-MS/MS)分析,从100μg鼠肝蛋白酶解液中共鉴定到属于605个糖蛋白的1 919个糖肽的1 350个N-糖基化位点。这些结果表明POP-1在糖蛋白质组学研究中具有较强的应用潜力。     

用于富集低分子量糖蛋白的多功能磁性纳米材料的制备

低分子量糖蛋白被认为是发现疾病生物标志物的宝库。特异性的萃取吸附剂对这一类化合物的萃取和富集是必不可少的。硼亲和材料在近年来取得了很大的发展,但专门用于选择性富集低分子量糖蛋白的硼亲和材料目前鲜有报道。该文提出了具有多种功能的磁性纳米颗粒(MNPs),用于低分子量糖蛋白的选择性捕获。该多功能磁性纳米颗粒是用硼酸功能化聚合物网络包裹的磁性纳米复合物。该多功能磁性纳米材料是利用磁性的纳米颗粒内核通过在其表面修饰苯硼酸功能团的聚丙烯酸高分子网络链制备得到。该材料不仅具有常规磁性材料在磁分离方面的基本优势,还能提供三重预先设计的先进功能:1)尺寸排阻效应,去除高分子量蛋白质的干扰;2)对低分子量糖蛋白的选择性萃取;3)保护捕获到的低分子量糖蛋白不被降解和污染。该材料的选择性萃取功能来自于硼酸配基与糖蛋白的顺式二醇部分的亲和性,而尺寸限制效应和保护功能则依赖于磁性纳米颗粒表面修饰的聚合物网络,允许低分子量化合物选择性通过。通过实验验证了这些预设的功能,且通过改变聚合物链长可以调节限径效应的阈值。这种多功能磁性纳米复合物可以进一步发展成有前景的纳米探针,不仅可以选择性捕获低分子量糖蛋白,还可以选择性捕获核苷和聚糖等其他具有重要生物学意义的顺式二醇分子。因此,该文报道的材料制备策略为从复杂样品中选择性萃取靶标化合物的多功能吸附剂的设计和合成提供了新思路。     

功能化磁性纳米材料在糖蛋白及糖肽富集中的研究进展

蛋白质糖基化作为最重要的翻译后修饰之一,在生物体诸如细胞信号转导、蛋白质翻译调控、免疫应答等诸多生命过程中发挥重要作用。此外,蛋白质的异常糖基化还与肿瘤等疾病的发生发展密切相关,这为以糖蛋白为目标的疾病生物标志物的发现提供了可能。尽管质谱已经成为糖蛋白质组学的重要分析工具,但糖肽的低丰度和低电离效率使得其直接质谱分析仍面临挑战。在糖蛋白质组学研究中,从复杂的生物样品中富集糖蛋白和糖肽是重要的环节。磁性固相萃取(MSPE)是一种操作简单、成本低和萃取效率高的样品预处理方法。在磁性固相萃取中,磁性吸附剂是影响萃取效果的关键,将功能化磁性纳米材料作为吸附剂进行糖蛋白质组学研究已经得到广泛应用。该文综述了糖分子、离子液体、凝集素、硼酸亲和配体、金属有机框架、共价有机骨架等功能化磁性纳米材料的制备及其在糖蛋白及糖肽富集中的应用。上述功能化磁性纳米材料具有高比表面积、大量作用位点等特点,其富集机理包括亲水相互作用色谱、凝集素亲和作用色谱、硼酸化学法和肼化学法等,主要应用于血清、血浆、细胞、组织、唾液等样品的糖蛋白和糖肽的富集。该文引用了近十年来发表的约90篇源于科学引文索引(SCI)与中文核心期刊的相关论文,并于文末对磁性纳米材料在糖蛋白和糖肽富集领域的发展趋势进行了展望。     

功能化磁性纳米粒子联合质谱技术用于金属硫蛋白的富集及鉴定研究

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一种具有结合金属能力和高诱导特性的低分子量蛋白质,因此常被作为一种重要的生物标志物用于水环境重金属污染评估。传统的金属硫蛋白富集检测方法耗时较长,操作复杂。本研究制备了金包覆四氧化三铁的核壳纳米粒子(Fe_3O_4@AuNPs),具有磁场的快速响应和特殊的光学特性的优点,并且可利用Au-S的强亲和力实现纳米粒子对金属硫蛋白的快速富集,进一步将纯化的蛋白质通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)进行分析检测。结果表明,Fe_3O_4@Au纳米粒子可以直接从复杂的溶液中富集MT,采用MALDI-TOF/MS鉴定分析,检出限达10 fg/mL。     

共价有机骨架功能材料及其在糖肽选择性富集中的应用

蛋白质糖基化是生物体中最重要的翻译后修饰手段之一,糖蛋白/糖肽的有效分离和富集成为目前糖蛋白组学研究的首要问题。对于复杂的生物样本,糖蛋白的数量较少,酶解后大量高丰度非糖基化修饰肽的存在,使得低丰度糖肽的检测更加困难。因此,需要一些手段来有效地富集糖肽以提高其检测丰度,发展高选择性的糖肽富集材料及方法就成为在分子水平上有效地监测糖蛋白或糖肽的重要途径。相对于传统的糖肽富集材料,共价有机骨架材料具有比表面积大和可修饰位点丰富的优点,在糖肽富集领域具有很大的应用潜力。该文制备了一种新型的共价有机骨架材料(O-T-D-COFs),利用1,3,5-三(4-氨苯基)苯和2,5-二甲氧基苯-1,4-二甲醛作为反应单体通过共聚缩合反应生成的席夫碱构成了材料的框架,对合成后的中间体材料进行氧化处理,从而提高材料的富集性能。利用扫描电镜、透射电镜、红外光谱和固体核磁等表征技术对材料的结构进行了表征,并将其应用于糖肽的选择性富集。分别对富集过程的上样条件、淋洗条件、洗脱条件进行了优化,结合质谱检测技术,从人血清免疫球蛋白G酶解液中观察到32个明显的糖肽信号峰。通过模拟复杂样本体系验证材料富集选择性,在人血清免疫球蛋白G和牛血清白蛋白的酶解液混合物摩尔比达到1∶50时,该材料仍然保持了良好的选择性。此外,还考察了材料的检测限、富集容量、回收率等富集性能,及在实际样品中的应用潜力。以人血清免疫球蛋白G为评价对象,O-T-D-COFs具有较低的检测限(2.5 fmol/μL)、较高的富集容量(120 mg/g),及较好的富集回收率(103.5%±6.6%、101.5%±10.4%)。在血清样品中富集到来自53个N-糖蛋白中的86个N-糖肽序列,并鉴定到了94个N-糖基化位点。这些结果都表明,该材料在糖肽富集领域有较好的应用前景。     

重组含糖识别结构域的人源半乳糖凝集素-3在糖蛋白/糖肽富集中的应用

植物凝集素是广泛使用的糖蛋白富集和识别材料,动物凝集素则较少被尝试用于糖蛋白富集。基于人源半乳糖凝集素-3的糖识别结构域（CRD）,设计了两种重组凝集素：Gal3C （一个CRD）和Tetra-Gal3C （四重串联CRD）。通过将两种凝集素固定于链霉亲和素琼脂糖小球上,构造了富集糖蛋白的重组凝集素亲和柱。使用凝胶电泳、免疫印迹以及生物质谱技术对重组凝集素的生物特征及其糖蛋白富集能力进行了表征与评价,发现两种类型的重组凝集素对糖蛋白/糖肽都有良好的富集效果,并具有较高的特异性和灵敏度。相对于Gal3C而言,Tetra-Gal3C由于具有四重串联的CRD结构域,表现出更高的糖蛋白/糖肽富集能力。该凝集素亲和柱成功用于人肝癌细胞系HepG2的糖蛋白富集,表明重组凝集素具有从复杂生物样本中选择性识别和富集糖蛋白/糖肽的能力。     

Selective enrichment of glycopeptides based on copper tetra(N‐carbonylacrylic) aminephthalocyanine and iminodiacetic acid functionalized polymer monolith

Efficient separation and enrichment of low‐abundance glycopeptides from complex biological samples is the key to the discovery of disease biomarkers. In this work, a new material was prepared by coating copper tetra(N‐carbonylacrylic) aminephthalocyanine and iminodiacetic acid onto poly(glycidyl methacrylate‐pentaerythritol triacrylate) monolith. The monolith was applied to polymer monolithic microextraction for specific capture of glycopeptides coupled with matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry. The developed monolith exhibited satisfactory efficiency for glycopeptide enrichment with high selectivity and detection sensitivity. When the tryptic digest of immunoglobulin G was used as the sample, total 24 glycopeptides were identified and the detection limit was determined as 5 fmol. When the approach was applied to the analysis of glycopeptides in the mixture of bovine serum albumin and immunoglobulin G (100:1, m/m) digests, 16 glycopeptides could still be observed. Moreover, the monolith was successfully applied to the selective enrichment of glycopeptides from human serum digests, exhibiting great practicability in identifying low‐abundance glycopeptides in complex biological samples.     

钴酞菁功能化聚合物整体柱的制备及用于转铁蛋白糖肽的富集

建立了一种新型的聚合物整体柱制备方法,将四羧基钴酞菁（CoPcTc）引入聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯）（Poly（GMA-EDMA））整体柱,用于转铁蛋白糖肽的富集。由于四羧基钴酞菁和糖肽之间的氢键和金属配位作用,制备的整体材料在用于糖肽富集时具有高效性和选择性。转铁蛋白经过功能化整体柱富集后,通过电喷雾四极杆飞行时间质谱分析,共捕获到17条糖肽。当转铁蛋白浓度降至8.8×10^-10mol/L时,仍然可以得到3条糖肽,说明合成的聚合物整体材料对微量蛋白样品分析具有很高的应用潜力。     

基质辅助激光解吸电离质谱和电喷雾电离质谱在辣根过氧化物酶糖肽结构分析中的应用

糖链结构的质谱解析是今后糖蛋白分析中的重要研究内容,其中完整糖肽的分析,由于可以同时获得糖基化位点和对应糖链的结构信息,更具有重要意义和研究前景。本工作对质谱软电离技术在完整糖肽分析中的应用进行了研究,其中包括了基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)和电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)技术。通过平行使用两种串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS)分析策略: MALDI-MS/MS和ESI-MS/MS对目标糖蛋白——辣根过氧化物酶进行分析,并讨论了其互补性。结果表明,MALDI和ESI技术各有优劣,结合串联质谱分析,可获得糖肽的糖链结构信息;两条路线互补使用,在揭示蛋白质糖基化修饰(位点和结构)的研究中十分必要。     

One-pot synthesis of magnetic colloidal nanocrystal clusters coated with chitosan for selective enrichment of glycopeptides

Selective enrichment of glycopeptides prior to the mass spectrometry (MS) analysis is essential due to ion suppression effect during ionization caused by the co-presence of non-glycosylated peptides. Among the enrichment approaches, hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) based on magnetic separation has become a popular method in recent years. As the conventional synthesis procedures of these materials are tedious and time-consuming with at least four steps. Herein, magnetic colloidal nanocrystal clusters coated with chitosan (Fe₃O₄@CS MCNCs) have been successfully prepared by a simple one-pot method. The resulting Fe₃O₄@CS MCNCs demonstrated an excellent ability for glycopeptide enrichment with high selectivity, low detection limit and high binding capacity. Furthermore, in the analysis of real complicated biological sample, 283 unique N-glycosylation sites corresponding to 175 glycosylated proteins were identified in three replicate analyses of 45 μg protein sample extracted from HeLa cells, indicating the great potential in detection and identification of low abundant glycopeptides in glycoproteome analysis.     

Design and fabrication of highly hydrophilic magnetic material by anchoring l-cysteine onto chitosan for efficient enrichment of glycopeptides

Hydrophilic interaction liquid chromatography(HILIC) has been recognized as an effective strategy for glycopeptide enrichment. Hydrophilic materials pave the way to solve the limit of low enrichment capacity and poor selectivity. The present study is the first attempt to combine chitosan(CS) and L-cysteine(L-Cys) to design a novel hydrophilic material focusing on glycopeptide enrichment. CS containing a large number of hydrophilic amino and hydroxyl groups has unique chemical properties, which m...     

Click maltose as an alternative to reverse phase material for desalting glycopeptides

Desalting peptides before mass spectrometry analysis is important because salts lead to adduct formation, increased chemical noise and ion suppression effect. A high concentration of salt can clog nanoelectrospray ionization (ESI) emitters. The reverse phase C18 material is commonly used to desalt peptides because of its high binding capacity. However, peptides with high hydrophilicity, such as glycopeptides, are not retained well on this material, resulting in the loss of peptide information. To improve the efficiency of glycopeptide desalting, we introduced a hydrophilic interaction chromatography (HILIC)-based material named click maltose. Four glycoproteins, horseradish peroxidase (HRP), human serum immunoglobulin G (IgG), bovine ribonuclease B (RNase B), and α-1 acid glycoprotein (AGP) were chosen as models and their glycopeptides were desalted with click maltose, AQ C18, Empore C18 and ZipTip C18. Click maltose as a HILIC material exhibited better performance than the other three C18 materials for both number of targeted glycopeptides and their corresponding intensities. In addition, accurate glycopeptide profiling was achieved with click maltose desalting regardless of peptide lengths and glycan types.