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中国人促红细胞生成素基因组的克隆及其在COS-7细胞中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
本文利用PCR技术,从正常人胎肝染色体DNA库中分离克隆了长度分别为506bp,465bp的中国人促红细胞生成素(EPO)基因组片段。506bp基因片段包括外显子2(信号肽),内含子2和外显子3;465bp片段包括外显子4,内含子4和外显子5。通过在引物中设置的酶切位点将两个克隆片段进行了正确的拼接,从而得到了约1.0kb的EPO次全基因组片段,它包括除信号肽中第2,3,4位氨基酸外的所有编码区及两个内含子序列。 所克隆的次全EPO基因组插入表达载体pSV2-dhfr中的不同克隆位点,构建了3种不同的转移载体质粒,分别转染导入COS-7细胞后,3种转移载体质粒转染的细胞上清液都有明显的EPO活性。本工作证明仅含有内含子2,4序列,去除负调控区和氧敏感区序列的人次全EPO基因组可以在COS-7细胞中获得表达。 相似文献
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毛细管电泳及其质谱联用技术分析重组人促红细胞生成素 总被引:3,自引:0,他引:3
用高效毛细管电泳测定了重组人促红细胞生成素(rhEPO)的微多相性、肽图,同时采用毛细管电泳质谱联用技术鉴定了部分非糖基化胰酶消解片段和O-126糖基化肽的结构。方法简便、快速,适用于rhEPO半成品的质量控制。 相似文献
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临床用重组人促红细胞生成素(rhEpo)是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell, CHO)表达的糖蛋白, 糖基对稳定蛋白的结构和生物活性非常重要, 但CHO表达体系生产成本高、产量低. 以大肠杆菌表达的促红细胞生成素为非糖基化蛋白(rh-ngEpo), 对其进行聚乙二醇(PEG)修饰可以提高蛋白稳定性和体内循环半衰期. 本文采用分子量为20000的N-末端专一性的单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)修饰rh-ngEpo, 对影响修饰反应的因素进行了考察. 结果表明, 在最佳反应条件下, 单修饰率可达55%. 修饰混合物经离子交换层析分离, 获得了纯度大于95%的单修饰产物, 其二、三级结构证明与原蛋白相似. 肽图分析结果表明, PEG绝大部分修饰在蛋白N-末端的氨基酸残基上. ELISA分析表明, 单修饰产物的体外活性虽然比修饰前减少30%, 但热稳定性得到显著增强, 在SD大鼠体内的药代动力学性质得到显著提高. 研究结果表明, PEG可以在一定程度上替代糖基的作用, PEG修饰的非糖基化Epo有望成为一种新型的促红细胞生成蛋白药物. 相似文献
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基于适配体的高特异识别能力和可扩增性,构建了经磁分离后实时定量PCR检测重组人促红细胞生成素-α(rHuEPO -α)的新方法;针对实际血清样品中高丰度蛋白质等的干扰,利用碱基互补配对原理设计合成了分别与适配体两端引物区结合的互补链,通过凝胶迁移阻滞分析(EMSA)筛选出最佳的互补链,并将生物素化的互补链连接到链霉亲和素磁珠上,以此为探针捕获复杂基质中形成的待测复合物.研究结果表明,结合该样品前处理策略,该方法可成功地应用于正常人血清中的rHuEPO -α定量检测,检出限为25pmol/L,线性范围为50 pmol/L~ 50 nmol/L. 相似文献
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采用生物膜干涉(BLI)表面敏感光谱技术,建立了一种基于链DNA适配体39 nt的传感分析方法,实现了重组人促红细胞生成素α(EPO-α)的灵敏检测。将生物素化的39 nt固定于链霉亲和素传感芯片上,经2200 r/min高速振荡实现微升体积分析物的快速扩散。对适配体39 nt的取向、在BLI传感芯片上的固定浓度和非特异性吸附等影响因素进行了考察,发现50 nmol/L 3’末端生物素化39 nt具有最佳响应信号;加入Tween 20和牛血清白蛋白(BSA)可有效克服非特异吸附。基于麦胚凝集素构建了夹心法信号放大体系,在Tris-TB生理缓冲溶液中,检测EPO-α的线性范围为10~200 nmol/L,检出限为5 nmol/L。应用于人血浆等复杂基质中的EPO-α检测,回收率为86.7%~104.2%, RSD<11%,结果令人满意。此BLI传感体系为免标记蛋白相互作用和复杂生物样品检测等实际应用提供了有益参考。 相似文献
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LI Wei Introduction In1986,Geysen[1]foundthatshortpeptidescon tainingthekeyresiduesofaproteincanmimicthede terminantoftheprotein;mostofthebindingenergybe tweenproteinsresultsfromthenoncovalentinteractions ofsomekeyresidues.Thesesmallpeptidesgenerally have… 相似文献
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设计合成了具有2个活性序列的线性和环状多肽及具有单个活性序列的短链多肽, 研究了它们的杀菌活性、 细胞毒性及溶血性. 结果表明, 线性肽和环状肽的杀菌活性高于短链肽. 利用计算模拟的方法计算了多肽与细菌细胞膜中一种重要的成分磷脂酰甘油(DMPG)的结合能. 结果表明, 多肽-DMPG的结合能与多肽的杀菌活性具有较高的相关性, 线性和环状多肽与DMPG的结合能大于短链肽. 线性和环状多肽均含有2个活性序列, 可提供多个荷正电氨基酸与荷负电的磷脂结合, 结合能较大, 杀菌活性较强. 采用模拟生物膜对其中几条多肽的作用机理进行了初步研究. 结果表明, 该类多肽有可能使正常哺乳动物细胞的细胞膜产生孔洞; 而对于细菌细胞膜, 多肽并未在膜上产生明显孔洞, 而是引起了细菌细胞膜的聚集. 相似文献
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Membrane-targeting host antimicrobial peptides (AMPs) can kill or inhibit the growth of Gram-negative bacteria. However, the evolution of resistance among microbes poses a substantial barrier to the long-term utility of the host AMPs. Combining experiment and molecular dynamics simulations, we show that terminal carboxyl capping enhances both membrane insertion and antibacterial activity of an AMP called P1. Furthermore, we show that a bacterial strain with evolved resistance to this peptide becomes susceptible to P1 variants with either backbone capping or lysine-to-arginine substitutions. Our results suggest that cocktails of closely related AMPs may be useful in overcoming evolved resistance. 相似文献
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用分子力学方法(MM)对间位聚苯(PMP)及其衍生物的势能随扭曲角(f)变化规律进行了研究.结果表明,势能曲线上出现四个能量最小值,分别对应于扭曲角f ≈-135°,-45°,45°,135°.进一步对以上构建的全部PMP及其衍生物用分子力场Drieding 2.11进行了分子力学能量优化.最终得到主要的四种构象,其中螺旋构象的能量最低,而且以螺旋构象为优势分布构象.在真实条件下,PMP及其衍生物长链可能采取以上四种构象的混合片段组成.用量子化学方法(GGA-DFT)研究了PMP及其衍生物的电子结构能隙随相邻苯环之间的扭曲角的变化趋势.用量子化学半经验方法(AM1)对四种构象分别进行几何优化,优化结果与分子力学优化结果基本一致,并运用混合密度泛函方法(DFT/B3LYP/6-31G)进一步对AM1优化的构象结构进行更精确的电子结构能隙计算.最终得出影响间位聚苯及其衍生物电子结构能隙的主要因素为连接苯环间扭曲角的大小. 相似文献
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应用AutoDock程序将SARS冠状病毒3CL蛋白酶及其抑制剂配体和受体进行了对接,并用InsightⅡ中的Discover 3模块进行了分子动力学模拟,分析了蛋白酶活性口袋的形状,讨论了其亚基的氢键、静电、疏水等相互作用,为进一步设计药物提供了重要的参考信息. 相似文献
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采用分子动力学模拟方法系统地研究了谷胱甘肽硫转移酶家族(Glutathione S-transferases,GSTs)的等位基因蛋白B(GSTP1*B)与抑制剂利尿酸(EA)以及EA的谷胱甘肽(GSH)共轭物EAG(I),EAG(O)的具体结合方式.抑制剂及其谷胱甘肽共轭物与蛋白的相互作用能计算结果及分子动力学轨迹的统计分析结果表明,GSTP1*B与EA的谷胱甘肽共轭物的结合能力优于其与EA的结合能力,Phe8,Arg13,Trp38和Tyr108是作用过程中的关键残基,对稳定抑制剂及其谷胱甘肽共轭物在GSTP1*B的G和H位点的构象具有重要的作用.通过对构象的统计分析发现,残基Phe8和Tyr108与GSTP1*B酶对抑制剂的选择性密切相关. 相似文献
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设计合成了多个具有2个活性序列的线性和环状多肽及具有单个活性序列的短链多肽, 研究了它们的杀菌活性, 发现其杀菌活性顺序为长链肽>环状肽>短链肽, 特别是线性的Linear-KT和Linear-KS对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有较高的杀菌活性. 采用MTT法考察了Linear-KT和Linear-KS对正常细胞的毒性, 其中Linear-KS表现出较低的细胞毒性, 优于阳性对照多粘菌素B. 利用计算模拟的方法计算了多肽与细菌细胞膜中磷脂酰甘油(DMPG)的相互作用. 结果表明, 多肽和DMPG的结合能也表现出长链肽>环状肽>短链肽的规律, 特别是Linear-KT和Linear-KS具有较高的结合能. 长链肽含有2个活性序列, 可提供多个荷正电的氨基酸与荷负电的磷脂结合, 结合能较大, 杀菌活性较强. 同时, 柔性的结构及Linear-KT和Linear-KS中丝氨酸和苏氨酸的β碳上的羟基可与磷脂上的羰基形成多个氢键, 进一步增大了结合能. 计算模拟的方法为抗菌肽的杀菌活性从理论上提供了一定的依据. 相似文献
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多巴胺第三受体蛋白三维结构及其活性位点氨基酸残基 总被引:1,自引:0,他引:1
基于牛视紫红质模板蛋白,同源模建多巴胺第三受体(D3R)蛋白三维结构,在1-棕榈酰-2-油酰-卵磷脂(POPC)膜-水模型环境,开展300 ns分子动力学模拟提炼优化其结构,取得稳定的D3R蛋白三维结构(2B08-D3R).在该蛋白基础上,采用MP2/6-31G(d,p)方法,计算多巴胺(Dop)与氨基酸残基相互作用的结合能,确定五个残基(Asp117、Ser208、His272、Phe269和Thr276)为活性位点.五个活性位点残基分别位于D3R蛋白跨膜螺旋区TM3、TM5和TM6,组成活性空腔结构.多巴胺分子以其苯基平面与TM2-TM7包围的圆柱体空腔平行和非共价键结合方式保留在D3R蛋白中,与D3R蛋白结合能Eb为-97.8 kJ·mol-1基于3PBL D3R突变体晶体结构,构建了另外一个含有多巴胺分子的D3R蛋白结构(Dop-3PBL-D3R),确定在该蛋白结构中,多巴胺的活性位点氨基酸是Asp83、His272、Phe269、Phe268和Trp265.在该蛋白结构中,多巴胺分子同样以其苯基平面与TM2-TM7包围的圆柱体空腔平行和非共价键方式结合,与该蛋白相互作用的结合能是-80.5 kJ·mol-1. 相似文献
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菜豆凝集素抑制剂的设计与凝血活性 总被引:1,自引:0,他引:1
针对菜豆凝集素二聚体复合物的结构特征,利用计算机辅助药物设计的方法设计抑制剂以破坏复合物结构;进一步采用标准的Fomc保护氨基酸NT氨基的固相法合成纯化了小肽抑制剂.体外兔血红细胞凝集实验结果表明,该小肽对菜豆凝集素的凝血能力有一定的抑制效果.该方法为植物凝集素凝血研究及菜豆相关的食品安全问题提供了一个新思路. 相似文献
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巴比妥酸系列衍生物第一超级化率的理论研究及分子设计 总被引:2,自引:0,他引:2
在ZINDO方法基础上,按完全态求和(SOS)公式编制程序并计算了第一超极化率β,研究了巴比妥酸系列衍生物分子的结构,光谱和第一超级化率β(-2ω,ω,ω),β(0,0,0),考察了给体、桥和受体的变化、D-π-A结构及D-A-D结构和D-A结构对β的影响,设计了一系列有实际应用价值的热稳定性好,具有优良非线性光学性质的分子。 相似文献