新型rPA(K)原核表达载体的构建及初步表达

利用PCR技术,获得了rPA(K)cDNA片段,将其克隆至pET-30a( ),成功构建了新型的rPA(K)原核载体pLrA(K),并实现了其在大肠杆菌中的初步表达,经IPTG(终浓度为1 mmol/L)分别于37℃诱导1,2,3 h后,以Bio-Rad凝胶成像仪分析目的蛋白,相对含量分别是19%,15.8%和24.3%,平均密度分别是0.13,0.14和0.16,IPTG诱导3 h后蛋白表达量最高.ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为210 μg/L.     

利用TMV病毒载体在烟草中瞬时表达rPA（Reteplase）

构建了携带有人组织型纤溶酶原激活剂突变体rPA（Reteplase）的烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus,TMV）瞬时表达载体PJL TRBO-rPA,并转入农杆菌GV3101中.利用农杆菌渗滤接种技术在烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）中进行表达.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（western blotting）和纤维蛋白琼脂糖平板（fibrin-agarose plate assay,FAPA）法检测分析.结果表明,在烟草中成功地表达出了有活性的rPA.为在植物中生产Reteplase提供了一条可能的途径.     

尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)系统在子宫内膜癌中的研究进展

尿激酶型纤溶酶原激活系统是纤溶系统的重要组成部分，它通过水解细胞外间质，参与组织改造和细胞迁移，在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥作用；讨论了uPA系统的结构、作用机理及与子宫内膜癌的关系，旨在为子宫内膜癌的诊断和治疗提供新方法。     

分泌性表达人rPA毕赤酵母工程菌株的构建及发酵条件的初步优化

通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断，将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPICgK／rPA，转化Pichia pastoris GS115宿主菌．通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His^ Mut^s表型转化子．并在2．0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10，GR11．摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明重组蛋白分子量约39ku，能与特异性单克隆抗体发生免疫反应；体外气泡法测定rPA活性，结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性．通过正交试验，优化发酵条件，表达活性最高为1050IU／mL．     

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

进行了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中实现了胞外表达。以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306染色体DNA为模板,通过PCR技术克隆了r-PA基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上并进行了序列测定。测序结果表明:克隆到的基因序列长1.1 kb,与已发表的Reteplase基因同源性达99.91%,其编码的氨基酸顺序一致。文中还构建了甲醇毕赤酵母分泌性表达载体pMETαA-r-PA,用PacⅠ单酶切将pMETαA-r-PA线性化后,采用电转化的方法将其导入甲醇毕赤酵母PMAD16中,PCR和表型鉴定表明,筛选到Reteplase基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上的阳性克隆。经摇瓶初步培养及以甲醇为唯一碳源诱导表达,胞外Reteplase表达水平最高达27.93mol/(s.L)。     

重组酿酒酵母r-PA发酵条件的优化

通过PCR技术对r-PA重组酿酒酵母进行了鉴定,并对该基因工程菌株生物合成r-PA的条件进行了优化。结果表明,其生物合成r-PA的最适发酵条件为:半乳糖诱导浓度为1.5%,诱导培养基起始OD600为0.3、起始pH7.0,250mL三角瓶最适装液量为60mL,诱导时间60h。优化前最高酶活为1926U/L,优化后最高酶活为5932U/L,较之提高了2倍。     

t-PA cDNA基因的克隆及测序

从基因工程菌株里氏木霉中提取基因组DNA,根据t-PAcDNA序列设计一对引物,利用PCR法扩增目的基因,将其与pMD18-T-Vector连接后转入大肠杆菌,通过Amp抗性和蓝白斑筛选出重组菌株,PCR法和双酶切法鉴定后再进行测序鉴定,测序结果表明:克隆的t-PAcDNA的第34位、450位和521位基因发生了突变。     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）在大肠杆菌中的表达、复性及分离纯化

人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ—ＰＡ）。ＤＮＡ重组在表达质粒ｐＤＲ７２０中，在Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中获得了表达，表达水平为２％．以醋酸钟显色ＰＡＧＥ凝胶回收ｔ—ＰＡ表达条带，进行复性处理．Ｒ性产物经Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，Ｌｙｓｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，纯化得到ＳＤＳ—ＰＡＧＥ银染一条带纯度，比活为为４，０００ｍｏｌ／ｓ·ｇ的人ｔ—ＰＡ．     

人tPA基因真核表达质粒载体构建及其生物学功能研究

构建携带组织纤溶酶原激活物(tPA)基因真核表达质粒pcDNA3.1( )/tPA,并研究其有无生物学活性.用RT-PCR法从人心脏组织中克隆tPA基因并将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1( )中,对pcDNA3.1( )/tPA进行酶切鉴定和测序.脂质体介导pcDNA3.1( )/tPA转染血管平滑肌细胞,分别用Nothern Blot和斑点印迹法从mRNA和蛋白质水平检测tPA的表达,并用纤维蛋白板法测定表达产物的生物学活性.成功克隆了人tPA基因并构建了pcDNA3.1( )/tPA真核表达质粒,pcDNA3.1( )/tPA转染VSMC后,tPA mRNA和蛋白质表达增加,所表达的tPA蛋白质具有纤溶活性.     

rPA(K)原核表达产物的复性与纯化

为探索新型rPA(K)在原核系统中表达产物的纯化和复性,采用不同的洗涤剂(脲、Triton X - 100、乙醇)依次洗涤包涵体,又经硫酸铵沉淀,得到了经初纯后纯度较高的包涵体.结果表明,经2mol/L脲、1mL/L Triton X - 100、200mL/L乙醇洗涤,15%饱和度的硫酸铵沉淀后,包涵体的纯度由16.0% 提高到56.6%.在此基础上,利用稀释复性和透析复性2种方法对包涵体进行复性,以恢复产物的天然构象,获得具有生物学活性的目的蛋白.结果如下:采用透析复性法,rPA(K)的比活可达1.33×105IU/mg;采用稀释复性法,rPA(K)的比活可达1.06×105IU/mg.利用S·TagTM rEK纯化试剂盒对目的产物进行进一步纯化,并对rEK和MgCl22种洗脱剂的洗脱效果进行了比较.SDS - PAGE结果显示,MgCl2洗脱后的产物,分子量未发生变化,仍为43ku,其纯度为72%;而rEK洗脱后的产物,其纯度达到了72%,且分子量减小至约40ku,表明去除了融合蛋白中的非目的片段.     

组织型纤溶酶原激活剂突变体基因转染细胞株的建立

以脂质体介导法将含有t-PA突变基因的真核表达载体pCSRA及pCSRK分别转染CHO-dhfr^-,经G418及DMEM双重选择,获得两者的稳定表达细胞株。结果表明,表达产物具有良好溶纤活性;Western印迹实验证明,产物具有特异抗原性;经多次传代,细胞株具有良好的稳定性。比较了无血清培养基CHO-S-SFMⅡ与常规培养基DMEM培养条件下pCSRK细胞株产物的表达量,前者约为后者的2倍,表明无血清培养基SFM有可能用于药用性蛋白的生产。实验为t-PA新型突变体的临床应用打下一定基础。     

人血小板生成素在COS－7细胞中的暂时表达

利用反转录ＰＣＲ获得的全长人ＴＰＯｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ的Ｎｈｅｌ位点，用ＤＥＡＥ-Ｄｅｘｔｒａｎ法将其导入ＣＯＳ-７细胞中．实验表明，所构建的表达质粒在ＣＯＳ-７细胞中有转录水平表达．ｈＴＰＯ在真核系统中的稳定表达正在研究中．     

增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建

构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的真核表达载体pCDNA3．1( )-EGFP,转染至培养的Hela细胞中成功表达,并发出绿色荧光,证明EGFP一种良好的报告基因和筛选标记．     

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表达

为建立溶栓药物瑞替普酶(r PA)的乳酸菌表达系统,从实验室前期构建的大肠杆菌表达质粒p ET22b-rpa上扩增出目的基因rpa,将该基因与乳酸菌表达质粒pCYT连接,构建了pCYT-rpa质粒.此外,为提高r PA在乳酸乳球菌NZ9000中的稳定性,同时构建了rpa位于葡萄球菌(Staphylococcal)耐热核酸酶基因nuc下游融合表达的重组质粒pCYT-nuc-rpa.将质粒p CYT-rpa和p CYT-nuc-rpa分别电转化至乳酸乳球菌NZ9000中,经Nisin诱导表达,Western blot结果显示Nuc可提高r PA在乳酸乳球菌中的稳定性,从而增加了rPA在乳酸菌中的表达量.重组r PA及Nuc-rPA在复性后均具有溶栓活性,活性分别为800,U/L和1,000,U/L.     

TBSV病毒瞬时表达载体构建及其表达

为了深入理解植物RNA病毒载体表达系统,初步建立了利用TBSV病毒表达载体在寄主植物烟草中表达外源蛋白的技术体系.以番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)为材料,构建了含报告基因sGFP的WY1,WY2等2个重组病毒表达载体,并将载体导入农杆菌GV3101用于侵染烟草植株叶片;利用农...     

结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达质粒的构建及表达

构建结核分枝杆菌Rv2450基因真核表达载体.PCR扩增Rv2450基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1（-）,重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pCDNA-Rv2450,RT-PCR结果证明Rv2450可在P815细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有Rv2450蛋白的细胞着染.成功构建了结核分枝杆菌Rv2450基因的真核表达载体pCDNA-Rv2450,Rv2450基因可以在P815细胞中表达.