基于核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的荧光适配体传感器用于卡那霉素的检测

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(CNPs)的信号放大体系用于卡那霉素(KAN)检测的新方法。合成了水溶性的CNPs,并设计合成了不同序列的DNA,具体包括:卡那霉素适配体(Apt),羧基荧光素标记的信号DNA探针(FAM-DNA)和互补链cDNA。当体系中不存在KAN时,Apt与cDNA可以杂交形成双链DNA,体系中FAM-DNA处于单链状态,Exo Ⅲ不能水解单链DNA;此时,体系中加入CNPs,单链FAM-DNA被CNPs吸附,荧光发生淬灭;在KAN存在下,Apt与其靶标KAN特异性结合,此时FAM-DNA与cDNA杂交形成双链DNA,由于CNPs对双链DNA吸附较弱,DNA探针的荧光不发生淬灭。ExoⅢ可以特异性的从3’-端对FAM-DNA降解,释放FAM荧光团和cDNA,该体系通过"降解-杂交"循环,最终释放出大量的FAM荧光团。由于CNPs对FAM具有较低的亲和力,释放出的FAM不能吸附在CNPs表面,FAM荧光不会发生淬灭,实现荧光信号放大扩增作用。方法线性范围为50～100 nmol/L,检测限为2.5 nmol/L。该方法可用于实际样品牛奶中卡那霉素的检测。     

基于核酸外切酶Ⅰ辅助目标物循环放大策略的非标记适配体荧光传感器检测土霉素

建立了基于核酸适配体的特异性识别和核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)辅助目标物循环放大的非标记荧光检测方法,用于土霉素的定量测定.体系中无土霉素时,SYBR Green I(SGI)分子可以插入土霉素适配体与其互补链形成的双链DNA(dsDNA)中,并在495 nm光激发下产生强烈的荧光发射.在土霉素存在时,由于核酸适配体与土霉...     

基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光碎灭性质的核酸检测方法

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法.首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2).由于两条探针核酸具有3'粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,因而被吸附于MoS2纳米片而猝灭其荧光.当目标DNA存在时,会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应,并将探针核酸降解成大量的不能吸附于MoS2纳米片表面的荧光碎片.在优化条件下,目标DNA浓度在0.5~6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系,检出限为0.28 pmol/L.与单重信号放大技术相比,本方法极大改善了分析灵敏度和检出限,且具有良好的单碱基错配区分能力.     

基于核酸外切酶Ⅲ及DNAzyme的铅离子荧光传感器的研究

利用DNAzyme及核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)构建了荧光生物传感器用于检测铅离子(Pb²⁺)。DNAzyme与底物探针结合并在Pb²⁺辅助作用下切割底物,使发夹结构的底物探针在环上修饰有RNA碱基处断裂,切割断裂底物探针后,DNAzyme被释放,继续与下一个底物探针结合并切割,利用DNAzyme可循环反复催化裂解底物的特性实现循环反应。底物探针被切割断裂后,形成的Y字形探针可与信标探针结合并打开其发夹结构,产生荧光信号,同时在ExoⅢ的作用下降解,从3′端开始切割水解被打开的信标探针,释放出底物探针,继续与下一个信标探针结合切割,形成第二步的循环信号放大。经过两步的循环反应,荧光信号得到不断增强,从而达到高灵敏检测的目的。200μL反应体系在37℃反应60 min后,其荧光信号与Pb²⁺浓度在0.05～200 nmol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为0.01 nmol/L。用于实际样品中Pb²⁺的检测,加标回收率为96.3%～108.3%。本方法具有简单、快速、高选择性、高灵敏的特点,在Pb     

基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测

设计合成了一种长臂发夹型核酸探针,结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法.当不存在靶DNA时,SYBR GreenⅠ荧光染料能够嵌入发夹型探针的茎部而发出很强的荧光,而当存在靶DNA并与发夹型探针杂交后,核酸外切酶Ⅲ从杂交产物的3'端开始水解发夹型探针,释放出靶DNA,并触发下一个酶水解反应,同时SYBR GreenⅠ染料也随发夹型探针水解而释放,导致荧光信号降低,从而实现了对DNA的免标记荧光信号放大高灵敏检测.该方法的检出限低至320 fmol/L,比传统双标的分子信标的方法降低了4~5个数量级,且该方法还具有免标记、简单、快速的特点.     

基于核酸外切酶Ⅰ催化的核酸降解反应构建乳腺癌细胞电化学传感器

基于核酸外切酶I选择性消化单链核酸的特点,使用MCF-7细胞表面过量表达的肿瘤标志蛋白MUC1的适体,构建了一种灵敏检测乳腺癌细胞的新型电化学传感器。核酸适体链与乳腺癌细胞MCF-7表面过量表达的肿瘤标志蛋白MUC1的结合会阻碍其与互补核酸探针链的杂交,所以电极表面固定的未杂交的核酸探针单链就会被外切酶I选择性消化从而失去末端的亚甲基蓝信号分子。因此,通过检测电化学信号的变化,此传感器在103~106cell/mL细胞浓度范围内线性检测乳腺癌细胞MCF-7,检出限为330 cell/mL,具有高度特异性,可以有效区分对照细胞胰岛β细胞。     

酶联适配体传感器比色检测牛奶中恩诺沙星残留

通过裁剪分析和共聚焦成像鉴定了适配体的结合域,根据结合域位于3'端茎-环的特点,建立了外切核酸酶Ⅰ依赖的酶联核酸适配体比色分析法检测恩诺沙星残留.波长450 nm吸光度与恩诺沙星浓度呈线性关系,方法的线性范围为36～254 μg/L,检测限为15 μg/L.实际试样检测显示:15个牛奶样本里有6个检出恩诺沙星残留,残留...     

聚集诱导发光分子/适配体/外切酶Ⅰ体系对可卡因的检测

<正>目前非法药物的滥用已经成为全球性的公共安全卫生问题之一[1～3].其中可卡因作为一种全球禁用的非法药物,长期滥用会对人体造成许多不良的影响,如精神疾病、失眠、抑郁和暴力倾向等,甚至威胁生命,同时,吸食可卡因还会导致出现各种社会问题[4,5].因此实现对可卡因的快速检测成为打击     

核酸外切酶Ⅲ辅助的DNA铽离子配合物时间分辨荧光检测黄曲霉毒素B1

基于适配体的高特异性识别能力,结合核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助的核酸信号放大策略和时间分辨荧光测量技术,构建了无标记、超灵敏的适配体荧光生物传感器(Aptasensor),用于检测黄曲霉毒素B1(AFB1).设计了两个无标记的功能核酸发夹,其中,含有AFB1适体序列的发卡H1作为识别元件,茎部含有富G序列的发卡H2作为...     

5'核酸外切酶特异性荧光探针的设计和应用

根据5'核酸外切酶与底物间相互作用的特点,设计开发了对其具有高选择性、高灵敏度的DNA荧光探针。该探针对5'外切酶的线性响应范围为0.005~0.1 U/m L,检测限为0.005 U/m L。方法可用于人血清样品中5'外切酶的一步快速测定,测得正常人血清中5'外切酶的含量为0.09±0.01 U/m L,回收率为100%±5%(n=3)。该研究为实时监测生物样品中5'核酸外切酶的含量变化提供了有力的工具,也将有助于深入研究核酸损伤的修复途径。     

基于无标记的核酸适配体荧光生物传感器检测凝血酶

设计了一个简单、通用、基于核酸适配体无标记的高敏感、高专一检测凝血酶的荧光方法。以无标记凝血酶核酸适配体单链DNA为识别元素,Pico Green染料传导互补双链的荧光信号。Pico Green是一种不对称菁,当其单独存在时不产生荧光信号,而当其被吸附到互补的双链DNA上时,可产生很强的荧光信号,但被吸附到单链DNA上时,却无明显的信号改变。基于该性质,将其用于凝血酶的检测。该方法对凝血酶的响应线性范围为1.0×10~(-14)~1.0×10~(-7)mol/L,相关系数(r~2)为0.99,检出限为1.0×10~(-14)mol/L。1.0×10~(-8)mol/L两种干扰物质(牛血清蛋白和细胞色素C)的存在不影响凝血酶的检测,表明该方法对凝血酶具有非常好的专一性。该方法成功应用于对人血清样品的检测,其平均回收率为97%~102%。方法可简单、灵敏、特异性地检测凝血酶,有望用于医学临床诊断等领域。     

基于石墨烯猝灭及核酸外切酶辅助循环放大适体传感器检测ATP

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助分析物循环放大原理,结合石墨烯(G)的超高荧光猝灭能力,以三磷酸腺苷(ATP)作为模型分析物,构建了一种新型的荧光探针,实现了ATP的高灵敏检测。两条DNA链各包含一部分ATP适体序列,其中1条DNA链的3'端修饰有荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)。当模型分析物不存在时,两条DNA链通过非共价π-π堆积作用吸附在G表面,导致FITC的荧光猝灭。当目标物ATP存在时,两条DNA链与目标物ATP进行特异性结合,形成一双链夹心结构,随后加入ExoⅢ,由于ExoⅢ可对该双链夹心结构的3'凹陷末端进行逐步水解,释放出目标物ATP和游离的FITC。释放出的目标物ATP可继续进入下一循环,不断产生游离FITC,游离FITC将脱离G表面,从而导致体系的荧光恢复,并且恢复的荧光强度与ATP浓度在0.02~1μmol/L范围内存在良好的线性关系,检出限(S/N=3)为9 nmol/L。     

基于核酸适配体功能化荧光氧化石墨烯的免标记“Turn-off”型Hg2+传感器研究

利用湿化学法制备出具有一定荧光性能的氧化石墨烯(GO)负载金纳米颗粒(AuNPs)复合材料(GO@AuNPs),并将巯基化单链富T核酸适配体(aptamer)结合在该复合材料的金纳米颗粒表面,形成aptamer功能化氧化石墨烯-金纳米颗粒复合物(aptamer-GO@AuNPs)。当汞离子存在时,由于7个T-Hg~(2+)-T结构的配位作用,aptamer折叠形成刚性的发夹状双链DNA结构,并使Hg~(2+)靠近石墨烯表面(少于1 nm),使得电子可沿着双链DNA通道从石墨烯转移到汞离子,从而猝灭氧化石墨烯的荧光,由此构建了一种基于石墨烯荧光猝灭的"turn-off"型荧光传感器。考察了多种因素对检测体系的影响,在最优实验条件下,此方法对Hg~(2+)的线性检测范围为0.5～80 nmol/L,检出限为0.3 nmol/L。应用于环境水体样品中Hg~(2+)的检测,加标回收率为96.0%～105%,相对标准偏差为1.4%～3.2%。该方法操作简单,有较强的抗干扰能力,灵敏度和选择性高,不需要标记,检测快速,可用于环境水体样品中Hg~(2+)的高灵敏检测。     

微流控阵列芯片上植物单细胞内3′核酸外切酶的荧光成像检测

制备了高活性的拟南芥原生质体。通过在微流控芯片上设计适合原生质体尺寸的微孔阵列和微通道流路,实现了拟南芥原生质体的在线纯化和单细胞阵列捕获,其捕获效率达到40%。利用电穿孔技术将能特异性检测3′核酸外切酶的核酸探针导入原生质体,实现了单个原生质体内3′核酸外切酶的成像。该研究为开展单细胞内多种核酸酶的高通量原位检测,以及相关调控过程的研究提供了重要的方法学手段。     

基于酶辅助的比率型电化学适配体传感器用于前列腺特异性抗原检测

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助靶标循环策略,构建了比率型电化学适配体传感器,并用于前列腺特异性抗原(PSA)的检测。利用亚甲基蓝(MB)作为内置参考信号,当PSA存在时,发夹探针1(HP1)的适配体序列与PSA特异性结合,引起ExoⅢ的2次切割过程,从而实现2次循环扩增反应,导致电极上更多的MB标记的发夹探针3(MB-HP3)被切割;再加入二茂铁(Fc)标记的DNA链(Fc-DNA)与MB-HP3酶切后的片段进行杂交;最终,Fc的信号(I_Fc)增加,而MB的信号(I_MB)基本保持不变。在最佳条件下,I_Fc/I_MB与PSA浓度的对数值在0.001～100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,检出限为0.24 pg/mL。该传感器在临床实际样品检测中具有较好的应用前景。     

基于酶催化反应的核酸定量新方法

近年来 ,将染料自缔合或诱导缔合用于核酸定量测定备受关注 [1～ 3 ] .但是将酶与染料的缔合用于核酸定量测定尚未见报道 .氯化血红素 (hemin)可作为辣根过氧化物酶 (HRP)的模拟酶 ,能催化 H2 O2氧化对 -羟基苯乙酸 (p- HPA)生成荧光产物——联二对 -羟基苯乙酸的反应 [4 ,5] .由于 hemin在碱性介质中是阴离子化合物 ,能与阳离子化合物如阿尔新蓝 (Alcian Blue 8GX)发生缔合作用 ,从而使自身的催化性质被抑制 .当加入带负电荷的脱氧核糖核酸 (DNA)时 ,由于阿尔新蓝与 DNA的强烈作用使hemin与阿尔新蓝的缔合物被破坏 ,hemin的催化活…     

基于金属有机骨架材料和酶切放大的适配体荧光法检测副溶血性弧菌

基于铜基金属有机骨架(Cu-MOF)的荧光猝灭性质、核酸适配体的选择识别能力及核酸外切酶的水解放大信号作用,建立了一种快速检测副溶血性弧菌(V.P)的适配体荧光法.该文在室温下合成Cu-MOF,对其形貌、结构、荧光猝灭机理进行了系统研究,考察了Cu-MOF的体积、猝灭时间、核酸外切酶用量、恢复时间及试剂加入顺序等分析条...