池蝶蚌IRAK4基因的克隆及功能

在优质淡水珍珠育珠贝池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)中获得白细胞介素受体相关激酶IRAK4基因cDNA全长序列,命名为HsIRAK4,其全长为2 617 bp, 5’端非翻译区(5′UTR)为146 bp, 3′端非翻译区(3′UTR)为797 bp, ORF框1 674 bp,编码557个氨基酸,包含2个保守结构域,即N端的死亡结构域(Death, DD)和激酶结构域(KD)。系统进化树分析显示,HsIRAK4与青蛤的同源性最高,与软体动物聚在一支,和鱼类、灵长类不在一支。采用Real time-quantitative PCR技术检测脂多糖LPS诱导后的HsIRAK4及其在TLR信号通路中的上游因子HsMyD88的mRNA表达水平,结果显示,HsMyD88和HsIRAK4在所有组织都有表达,并且HsMyD88和HsIRAK4都在肝胰腺、鳃、肾和肠等免疫相关组织中高表达,二者在LPS刺激后不同组织达到峰值的时间明显存在差异,说明HsMyD88和HsIRAK4很有可能参与贝类动物的免疫防御。池蝶蚌GST-Pulldown结果显示,HsMyD88的Death结构域分别能和HsIRAK4-Death和HsIRAK4-ORF发生相互作用。     

水质因子季节变化规律及对池蝶蚌生长的影响

为探究淡水珍珠育珠蚌养殖水域水质因子季节变化规律以及对珍珠蚌生长的影响,以优质淡水珍珠蚌池蝶蚌养殖为对象,2017年6月～2018年5月对两个不同养殖基地进行了为期1年的水质变化监测和池蝶蚌生长观测,分析了部分水质因子与池蝶蚌生长的动态关系。结果表明:夏季是池蝶蚌最佳生长季节,该季节的养殖水体内悬浮颗粒有机物含量越高,池蝶蚌生长率越高;总碳高且稳定的状态可令生长率值较高,而总氮越稳定越有利;较高的pH值（8.0～9.0）可以较好地保证池蝶蚌生长率的提高;盐度在0.15～0.30范围内,养殖水体盐度越高越有利于池蝶蚌生长;Chl-a在10.00 mg·L-1左右时更适宜蚌的生长,当超过15.00 mg·L-1时则不利于其生长;藻蓝蛋白含量为2506.38～9464.25 mg·L-1,与池蝶蚌生长正相关,能体现池蝶蚌的滤食作用。     

池蝶蚌细胞色素P450 cDNA及其蛋白的序列分析

在实验室已获得的池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)部分细胞色素P450基因序列的基础上,运用RACE PCR的方法获得池蝶蚌细胞色素CYP基因(定义为Hs-CYP450)的全长cDNA。运用相关生物软件和在线软件对HsCYP450基因序列以及其蛋白的一、二、三级结构进行了初步分析。结果显示,Hs-CYP450基因全长1 809bp,ORF框1 431bp,共编码476个氨基酸;氨基酸组成成分中亮氨酸(Leu)含量最多,约9.5%,而最少的则是色氨酸,仅0.8%;通过疏水性分析显示,该蛋白属亲水性可溶性蛋白;二级结构预测显示该蛋白α螺旋(H)结构含量较多,约占46.22%,并均匀分布在蛋白中;β折叠(E)相对较少,约9.87%左右,多分布在两端。建立的系统进化树结果表明,Hs-CYP450基因序列与其他动物的细胞色素CYP基因有较高的同源性,在众多物种中和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)同源性相对较高。     

池蝶蚌(Hyriopsis schlegeli)血淋巴的抗菌力、溶菌酶和酚氧化酶活力

通过分光光度法对池蝶蚌的抗菌力,溶菌酶和酚氧化酶活性进行了分析.结果表明,经嗜水气单胞菌感染后,池蝶蚌对这两种细菌的抗菌力分别为0.61±0.01 U和0.14±0.02U;所有实验组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑制效果.随着年龄的增长,溶菌酶活性也显著增加,第4龄蚌的溶菌酶活力可达0.93±0.05U,比1龄蚌的酶活力高一倍左右;十二烷基磺酸钠(SDS)能够激活酚氧化酶(PO)酶原系统,2龄前,酚氧化酶活力逐渐增强,3龄和4龄逐渐减弱,2龄蚌的PO活性最高,为22.70±4.39 U.研究表明,池蝶蚌血淋巴中免疫因子的种类和表达活性在个体不同发育阶段中呈现出差异,推测可能与水体环境对蚌的作用有关.     

池蝶蚌(Hyriopsis schlegerli)对三角帆蚌病源的抗病性

采用3种方式对池蝶蚌进行感染试验。第一，在三角帆蚌蚌瘟病发病区同时吊养的池蝶蚌育珠蚌未见有感染现象；第二．将已经发病的三角帆蚌蚌肉组织捣碎后，放入水簇箱中，箱内分别为1—4龄4个年龄段的池蝶蚌和三角帆蚌，25d后，水温为20—26℃下．四个不同年龄段的三角帆蚌感染率超过65％，感染死亡率大于70％，而池蝶蚌的感染率低于25％，感染死亡率为40％-60％。第三，注射嗜水气单胞菌感染试验，三角帆蚌感染率为50％-90％，以2龄和3龄较重，感染死亡率67％-95％，池蝶蚌的感染率为20％-35％，感染死亡率为75％-100％。初步结果表明，池蝶蚌对三角帆蚌蚌瘟病相关病源和嗜水气单胞菌有一定的抵抗能力，且抗病力明显强于三角帆蚌。     

池蝶蚌金属硫蛋白基因的原核表达及活性分析

筛选池蝶蚌性腺转录组并运用RT-PCR方法扩增池蝶蚌金属硫蛋白(metallothionein,MT)ORF框序列。该序列有216个碱基组成,编码71个氨基酸,其中半胱氨酸含量丰富,富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys结构。多序列比对表明,池蝶蚌MT蛋白序列和其他物种MT序列有很高的同源性,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)MT蛋白具有100%的同源性。将该ORF框片段导入原核表达载体pET-32a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为27kDa,在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导4h表达量最高,重组蛋白主要存在上清液中,纯化并获得了重组蛋白。细胞增殖实验表明,纯化的MT融合蛋白有生物活性并能有效地减轻宫颈癌Hela细胞的氧化胁迫效应。     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著;而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.     

池蝶蚌鳃的显微结构观察

为了探讨池蝶蚌非繁殖期和繁殖期鳃的结构与功能的适应,取池蝶蚌的鳃制作组织学切片,对非繁殖期和繁殖期的鳃进行组织学形态结构的观察。结果表明,池蝶蚌内、外鳃的鳃丝上密布纤毛,鳃丝从外到内,其结构可以分为:上皮、基膜和结缔组织。繁殖期与非繁殖期比较,雄性池蝶蚌的内、外     

池蝶蚌外套膜的组织学观察

运用组织学方法对池蝶蚌不同部位外套膜进行了研究。结果表明,池蝶蚌外套膜由边缘膜和中央膜组成,边缘膜包括3个突起,分别是生壳突起,感觉突起和缘膜突起。不同部位外套膜的组织结构基本相同,由外表皮、内表皮和结缔组织组成。内表皮细胞间分布有3种类型的分泌细胞,分别是嗜碱     

池蝶蚌精子形态及其活力

池蝶蚌精子具有子弹形头部及细长均匀鞭毛尾,属鞭毛型。全长为254.91±20.03μm;头部子弹形,长为32.33±2.15μm,宽为16.60±3.29μm;鞭毛细长均匀,长为216.67±19.73μm。为了更好的计算池蝶蚌精子的存活率,本研究采用曙红Y染色的方法,观察了精子在生理盐水、池塘水和蒸馏水中的存活时间及运动方式。结果显示,精子在生理盐水中的存活时间最长,可达6h;其次是蒸馏水,约为4.5h;最短存活时间是在池塘水中,约为4.0h。池蝶蚌精子的主要运动方式有快速直线游动、弧线运动和原地转动3种方式。快速直线游动的精子活力最高,其次是弧线运动,精子活力降低后进行原地转动。研究的结果对池蝶蚌家系的建立起重要作用。     

基于转录组分析不同温度下池蝶蚌性别相关基因的表达

采用Pacbio三代和Illumina二代测序技术对不同温度(15℃,20℃,25℃,30℃,33℃)条件下养殖的30月龄池蝶蚌性腺组织进行转录组分析。通过差异分析获得各个温度下雌雄对比组的差异基因,数量分别为6 311,3 013,6 673,6 798和5 685个。其中在20℃和33℃下差异基因数量最少。差异表达基KEGG富集显示,25℃条件下出现卵母细胞的有丝分裂,细胞周期和notch信号通路等雌性相关活动。对五个温度处理组之间的差异表达基因进行组间比较,发现含有802个共同表达差异的基因,其中鉴定到wnt4,rspo1,fem1和tra1等4个性别决定相关基因。在qRT-PCR和转录组数据中,各温度下wnt4,rspo1的表达水平雌性均显著(P<0.01)高于雄性;而fem1,tra1相反。根据wnt4,rspo1,fem1和tra1在不同温度下的相对表达情况和差异基因的KEGG富集结果表明,25℃以上更利于雌性发育,其发育机制还有待深入研究。     

草鱼NF-κB2和IκBα基因的组织分布及对GCRV病毒感染的应答分析

NF-κB是具有多向性调节作用的蛋白质分子,NF-κB信号通路通过调控免疫相关基因的表达在鱼类先天性免疫中发挥重要作用,对该信号通路中2个关键信号分子NF-κB和IκB基因结构和表达模式研究非常重要。本文中,我们克隆了草鱼的NF-κB2和IκBα2个基因。氨基酸序列分析显示,NF-κB2含有1个RHD结构域、1个IPT结构域、6个ANKs结构域和1个Death结构域;IκB含有7个ANKs结构域。Real-time PCR分析发现,健康鱼体内NF-κB2在肝脏组织中表达量最高,IκBα在肾中表达量最高。GCRV病毒感染后,NF-κB2在肠中出现了显著的上调表达;IκBα在肝脏中产生了显著的下调表达,在肠中出现了小幅度的上调表达。说明NF-κB2和IκBα在病毒感染后的肝脏和肠中产生了主要的免疫应答,具体应答机制还有待进一步的研究。本研究结果为NF-κB2和IκBα在硬骨鱼类的抗病毒功能研究提供了重要线索。     

池蝶蚌(Hyriopsis Schlegelii)线粒体DNA COII基因的序列分析

用细胞色素氧化酶Ⅱ基因特异性引物,对人工选育后的F3代池蝶蚌的线粒体细胞色素氧化酶Ⅱ基因进行PCR扩增和双向测序,在10个个体中均得到序列一致的细胞色素氧化酶Ⅱ基因序列,长度为681bp;A、T、G、C含量分别为19.4%(132个)、30.4%(207个)、38.9%(265个)和11.3%(77个),A+T含量(58.3%)明显高于G+C(41.7%)含量,与其它淡水珠蚌科种类相同基因片段的碱基含量相似;密码子上4种碱基使用出现偏倚性,密码子第1位上碱基G使用率高达38.8%,碱基T为29.5%;密码子第2位上碱基T的使用率为38.8%,碱基C的使用率低至15.9%;密码子第3位上碱基T的使用率高达48.5%,而碱基C的使用率仅为4%;第3位碱基T的使用率比第二位高,这种递增现象也出现在高等无脊椎动物昆虫的COⅡ上。BLAST结果显示池蝶蚌COⅡ与三角帆蚌具有较高的同源性,相似性为95%,MP法构建的分子系统进化树表明这两种淡水珍珠育珠蚌的亲缘关系最近。     

磁珠富集法筛选池蝶蚌微卫星分子标记

通过磁珠富集的方法分离池蝶蚌(Hyriopsis Schlegelii)的微卫星分子标记。将池蝶蚌基因组DNA酶切,连接Brown接头,采用PCR技术富集,与探针杂交后杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,再将这些片段洗脱,PCR扩增,克隆构建含有微卫星片段的"基因组文库",所得到的阳性克隆进行测序。从所获得的212个阳性克隆中选取110个进行测序,其中54.5%含有微卫星序列,80%的重复序列重复数在10以上,微卫星序列中21.4%为完美型。除探针中使用的AC、AG等重复单元外,还观察到CT、GA、ATG等重复序列。设计获得60对微卫星引物,合成其中的30对经PCR筛选,结果有10对引物扩增出多态性条带。该实验表明:磁珠富集法是获得池蝶蚌微卫星分子标记的一种有效的方法,同时,制备出的微卫星标记可为今后研究池蝶蚌分子遗传多样性提供有用的遗传标记。     

褶纹冠蚌硫氧还蛋白基因克隆及空间结构分析

运用RACE-PCR方法从褶纹冠蚌血细胞中克隆出硫氧还蛋白(Trx)的cDNA。结果表明褶纹冠蚌TrxcDNA序列全长为1 169bp,其中5′非编码区(UTR)长11bp,3′非编码区长840bp,含有PolyA尾和典型的腺苷酸信号序列AATAAA,开放阅读框长度为318bp,编码105个氨基酸。预测蛋白质分子量为11.6kDa,等电点为5.38,未发现有信号肽。氨基酸序列中含有1个Thioredoxin结构域(T3-K104),区域内包含一个保守的CGPC活化位点。序列同源性比较结果显示褶纹冠蚌Trx与太平洋牡蛎和紫贻贝的氨基酸序列一致性分别为56%、52%。预测的Trx空间结构由5个β折叠和4个α-螺旋组成,α-螺旋包围β折叠形成紧密的球形,这一结构与人的Trx空间结构相似。     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP70基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列。用半定量PCR方法研究了HSP70mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况。结果表明:HSP70cDNA全长为2 664bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1 917     

不同施肥条件下池蝶蚌养殖池塘季节性浮游植物群落间的差异

池蝶蚌(Hyriopsis schlegeli)原产于日本琵琶湖,1997年引入中国并繁殖成功。实践证明,池蝶蚌的育珠能力强,质量优,已在全国淡水珍珠主产地推广养殖。为了解不同投饵施肥方式所提供的食物和生存的环境,2010年5月至2011年3月间对池蝶蚌养殖池塘的浮游植物群落结构进行了9次调查。全年共检测到浮游植物103种(属),不同施肥方式浮游植物的密度范围分别为:未施肥池塘在1.8×105～289.5×105 cells/L之间;施含益生菌发酵有机肥的池塘在12.9×105～705×105 cells/L之间;施发酵后的鸡粪肥池塘在5.4×105～481.6×105 cells/L之间。全年采样中未施肥池塘浮游植物密度显著低于施肥池塘的浮游植物密度;施含益生菌肥池塘与施发酵鸡粪肥的浮游植物密度之间无显著性差异,而益生菌肥用量是鸡粪肥的一半,因此益生菌肥更有利于浮游植物的生长,且对池塘污染小。3种施肥情况的全年群落组成5,6,7月均以绿藻占优势;8,9,10月以绿藻占优势,蓝藻占次优势;11,12和次年3月以隐藻占优势。抚州池蝶蚌养殖基地四季不分明的特点,春较短,冬季较长,夏、秋、冬季分割明显;蓝藻门、硅藻门主要分布秋季,隐藻门主要分布在冬季和早春。     

褶纹冠蚌(Cristaria plicata)热休克蛋白70的原核表达及多克隆抗体制备

构建褶纹冠蚌热休克蛋白70基因的原核表达质粒pET30a-cpHSP70,并经酶切和DAN测序鉴定。将其转入到表达宿主BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western-blot检测。结果显示:新表达的重组蛋白分子量约为74kD。在IPTG的诱导下,其表达量随时间的增加而增加,最适表达条件是37℃诱导8h。表达蛋白可溶性分析发现,一部分蛋白以不溶性的包涵体形式存在,一部分蛋白以可溶性蛋白形式存在。Westernblot检测显示蚌在35℃热激诱导1h后,其血、鳃、肌肉、肝胰腺和外套膜组织cpHSP70蛋白表达水平相对于蚌在20℃暂养3h后的表达量明显升高。     

背瘤丽蚌[Lamprotula leai Gray.1835]的年龄与生长

应用贝壳切片法鉴定背瘤丽蚌年龄。分析了背瘤丽蚌年龄、壳长、壳宽、壳高、体重和软体组织重之间的相互关系。结果显示：背瘤丽蚌壳长（L）、壳宽（W）、壳高（H）之间均呈线性关系,直线方程分别为：W=0．2651 L＋7．2227（R^2=0．9694）,H=0．3723 L＋4．7466（R2=0．9725）,H=1．3639W-4．4018（R^2=0．9466）;背瘤丽蚌的壳长、体重（Wb）、软体组织重（W1）和壳重（W）之间呈明显的幂函数关系,方程分别为：Wb=0．0007 L^2.6382,Wt=0．0001 L^2.5588,Ws=0．0006 L^2.6514。背瘤丽蚌的壳长与年龄（A）呈对数关系,方程为：L=30．558ln（A）＋20．036（R^2=0．9939）;壳年增长（△L）与年龄也呈对数关系,方程为：△L=-5．591ln（A）＋16．157（R^2=0．8828）。背瘤丽蚌自然种群中,最大年龄为17龄,最大壳长为101mm。     

草鱼CCL4基因的克隆及表达

草鱼CCL4基因全长854 bp,最大开放阅读框位于104~397 bp,编码97个氨基酸,其中32~73氨基酸为其保守的CC趋化因子家族结构域,N-端有1个由24个氨基酸组成的信号肽。草鱼CCL4与斑马鱼的同源性为69%,与其他鱼类和哺乳类的同源性在50%以下。系统进化分析也显示其与斑马鱼CCL4基因的亲