基于稳定同位素标记与质谱分析的蛋白质定量算法研究进展

蛋白质定量研究已成为蛋白质组学的热点,它是疾病相关生物标志物发现的重要途径.基于稳定同位素标记的质谱分析技术是蛋白质定量最常用的方法之一.随着实验方法的发展和改进,定量数据处理方法也在不断更新与完善.一般来说,定量数据处理包括四步:搜库鉴定、图谱定量信息提取与计算、肽段丰度比计算和蛋白质丰度比计算及差异显著性分析,其中后三步是数据处理的核心.目前,后三步中每步都有多种可选算法,这些算法一般都是针对特定实验技术而提出的,缺乏深入的工作对它们进行系统比较和优化.为此,在总结目前主要实验技术方法的基础上,论述了定量算法的现状和存在问题,并针对一些问题提出了可行的解决办法.     

无标记定量法研究冠心病不稳定性心绞痛血瘀证的差异蛋白质组

应用高解析离子淌度质谱(HDMS)与纳升级超高效液相色谱(UPLC)联用, 寻找冠心病不稳定性心绞痛血瘀证血浆差异蛋白, 探索冠心病不稳定性心绞痛血瘀证的蛋白质组学特点. 采用美国Agilent公司多克隆抗体亲和柱去除冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者和健康人血浆中6种丰度最高的蛋白后, 进行无标记定量蛋白质组(Label free proteome)分析. 结果表明, 本方法的离子强度变异系数小于5％, 保留时间变异系数小于3％, 具有良好的重现性. 动态范围约104数量级. 总蛋白数3843种, 差异倍数大于1.5倍的差异蛋白数25种, 上调蛋白数13种(包括心绞痛血瘀证患者独有蛋白3种), 下调蛋白数12种. ACTA1, ITIH3和 LBP仅在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者血浆中表达, Haptoglobin, SAA, CP, C6, MYH11, APOH和ANXA6在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者中高表达, 而HBB, HBA, HBE, HBD, HBG, HRG, IGHG, GSN和TF在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者中低表达. 表达上调的差异蛋白根据功能可分为: (1) 急性时相反应蛋白; (2) 补体蛋白; (3) 细胞骨架蛋白; (4) 凝血相关蛋白. 表达下调的差异蛋白根据功能可分为: (1) 载脂蛋白; (2) 运输蛋白; (3) 抗凝血相关蛋白; (4) 免疫球蛋白; (5) 细胞骨架调控蛋白. 以上结果提示, 冠心病不稳定性心绞痛血瘀证可能属于一种炎症反应; 冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者可能同时存在心肌损伤、凝血因子异常、脂代谢紊乱与氧运输障碍; 这些方面相互影响, 互为因果. 这些差异蛋白可为研究或发现抗心绞痛药物作用的新靶标提供线索. 本研究结果表明, 非标记定量蛋白质组学(Label free proteomics)是疾病及证候生物标志物研究的一种有效手段.     

基于质谱技术蛋白质定量方法的研究进展

质谱技术已经成为目前蛋白质鉴定的重要工具。定量分析细胞内蛋白质组的动态变化,是当前研究蛋白质功能、揭示细胞生物机理、寻找疾病蛋白标记物和药物靶标的迫切需要。本文综述了基于质谱技术蛋白质定量的策略、方法和应用等方面近年来的进展,评述了几种蛋白质质谱定量方法的特点和应用潜力。     

螯合稀土金属标记蛋白质技术的建立与优化

建立了一种基于螯合稀土金属标记蛋白质的技术,优化了影响标记效率的各种条件.在50 mmol/L TEAB缓冲体系(pH 7.5),DTPA与肽段摩尔比为100: 1,常温反应30 min的条件下,DTPA标记完全;在100 mmol/L乙酸铵缓冲液(pH 6.0),稀土金属与DTPA摩尔比为4: 1,37 ℃反应1 h的条件下,稀土金属螯合反应完全.考察了不同稀土金属的螯合效率,发现离子半径最小的Lu螯合效率最高.本方法被成功应用于肽混合物标记.     

18O稳定同位素标记定量蛋白质组研究技术的建立与优化

建立了18O稳定同位素标记方法,用于复杂体系蛋白质相对定量分析。对影响蛋白质标记稳定性的实验条件进行了比较和优化。结果表明,采用酶切后标记的方法,酶切肽段在胰酶催化下,在pH 5.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲体系中,37℃18O标记反应16 h,绝大部分肽段即可达到100%的标记效率。对多个16O/18O成对肽段峰强度的动态范围及定量准确度进行了考察。结果表明,18O标记方法是一种简便、稳定、可靠的相对定量方法,10倍动态范围内,标记率相对标准偏差在18.4%以内,16O/18O峰强度呈很好的线性关系。本实验考察了标记后的肽段在不同溶液体系中的稳定性,为复杂样品的预处理和预分离的溶液条件提供了依据。     

基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记定量蛋白质组学方法的建立与优化

建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记,定量蛋白质组学研究方法,优化了影响标记效率的各种条件。在pH8.0的Na2B4O7/H3BO3缓冲体系中,当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量,22℃反应30 min时,标记即可完全。对多对H6/D6-乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察,并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点。结果表明:在10倍和30倍动态范围内,线性关系良好(r=0.99,r=0.98),理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%。     

基于稳定同位素标记的蛋白质组学定量方法研究进展

定量蛋白质组学已经成为后基因时代的重要研究方向之一。目前该领域的研究主要采用无标记定量方法和稳定同位素标记定量法。其中,基于稳定同位素标记的蛋白质组定量方法发展非常迅速,已为生命科学研究提供了重要的技术支撑。本文分析了基于稳定同位素标记的蛋白质组学定量方法,包括相对定量方法和绝对定量方法,并对其发展进行了展望。     

金属标记结合高效液相色谱-选择离子监测质谱的蛋白质绝对定量新方法

建立了金属标记结合高效液相色谱-选择性离子监测质谱(SIM)的蛋白质绝对定量新方法。实验考察了金属标记效率、金属标记的稳定性、标记后肽段的色谱保留和质谱行为、新定量方法的线性范围和准确度。实验结果表明金属标记具有标记效率高,稳定性好,色谱保留行为一致等优点。另外,金属标记-选择离子监测质谱绝对定量方法灵敏度高,其定量限低至1 fmol,线性范围为1~500 fmol,线性范围内R2值大于0.99,具有良好的线性关系;经过测量,标准肽段的回收率为117.01%,说明该方法具有较高的准确度。将该方法应用于腾冲嗜热菌中烯醇酶蛋白的定量分析,相对标准偏差为5.47%,表明该方法的精密度高。以上结果表明该方法可以用于生物样本中的蛋白质的绝对定量分析,为比较简单的生物样本中蛋白质的绝对定量方法提供了一种新的选择。     

同系物标记结合凝胶电泳和质谱技术用于蛋白质N端肽鉴定及相对定量

通过酸酐同系物标记蛋白质的N-末端,经过凝胶电泳分离,使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行鉴定,建立了一种基于化学标记和质谱技术的、用于蛋白质的N-末端鉴定和相对定量新方法。标记后的蛋白质的N端肽以相差14 Da的成对峰形式在质谱中出现,而非N-末端肽则是以单峰呈现,从而实现了末端肽的特异性识别;通过端肽的信号强度对3种标记蛋白质的不同比例的混合溶液实现了相对定量分析。     

人血清内源性多肽无标记定量分析新策略

多肽组学(Pepti domics)以其在疾病标志物发现中所起的重要作用正受到越来越多的关注.然而,目前尚缺少针对多肽组学的高效定量方法.本文建立了一种基于纳升液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用(μLC-Q-TOF-MS/MS)系统的色谱峰面积无标记多肽定量方法.该方法首先对两组样品中的多肽进行相对定量,然后选取相对量大于2或小于0.5的多肽,用纳升液相色谱与串联二级质谱(μLC-MS/MS)的选择性数据依赖模式(DDA)进行序列鉴定.将不同量标准样品牛血清白蛋白(BSA)酶解液加入到相同量的正常人血清样品中,然后用该方法进行定量分析,得到的定量结果平均相对偏差为6.42%.该方法分别被用于健康人血清与肝细胞癌(HCC)以及乳腺癌病人血清中内源性多肽的定量比较分析,并成功鉴定了血清中一些与HCC和乳腺癌相关的内源性多肽.由于Q-TOF-MS/MS的高分辨率和宽质量检测范围,价态高达+5和分子量超过4000的多肽也可被可靠地进行定性和定量分析.实验结果进一步表明在多肽组学分析中μLC-Q-TOF-MS/MS比传统的MALDI-TOF-MS具有更高的检测灵敏度.     

Label-free quantification of differentially expressed proteins in mouse liver cancer cells with high and low metastasis rates by a SWATH acquisition method

Label-free quantification is a valuable tool for the analysis of differentially expressed proteins identified by mass spectrometry methods.Herein,we used a new strategy:data-dependent acquisition mode identification combined with label-free quantification by SWATH acquisition mode,to study the differentially expressed proteins in mouse liver cancer metastasis cells.A total of 1528 protein groups were identified,among which 1159 protein groups were quantified and 249 protein groups were observed as differentially expressed proteins(86 proteins up-regulated and 163 down-regulated).This method provides a commendable solution for the identification and quantification of differentially expressed proteins in biological samples.     

Quantitative Proteomics and Differential Protein Abundance Analysis after Depletion of Putative mRNA Receptors in the ER Membrane of Human Cells Identifies Novel Aspects of mRNA Targeting to the ER

In human cells, one-third of all polypeptides enter the secretory pathway at the endoplasmic reticulum (ER). The specificity and efficiency of this process are guaranteed by targeting of mRNAs and/or polypeptides to the ER membrane. Cytosolic SRP and its receptor in the ER membrane facilitate the cotranslational targeting of most ribosome-nascent precursor polypeptide chain (RNC) complexes together with the respective mRNAs to the Sec61 complex in the ER membrane. Alternatively, fully synthesized precursor polypeptides are targeted to the ER membrane post-translationally by either the TRC, SND, or PEX19/3 pathway. Furthermore, there is targeting of mRNAs to the ER membrane, which does not involve SRP but involves mRNA- or RNC-binding proteins on the ER surface, such as RRBP1 or KTN1. Traditionally, the targeting reactions were studied in cell-free or cellular assays, which focus on a single precursor polypeptide and allow the conclusion of whether a certain precursor can use a certain pathway. Recently, cellular approaches such as proximity-based ribosome profiling or quantitative proteomics were employed to address the question of which precursors use certain pathways under physiological conditions. Here, we combined siRNA-mediated depletion of putative mRNA receptors in HeLa cells with label-free quantitative proteomics and differential protein abundance analysis to characterize RRBP1- or KTN1-involving precursors and to identify possible genetic interactions between the various targeting pathways. Furthermore, we discuss the possible implications on the so-called TIGER domains and critically discuss the pros and cons of this experimental approach.     

On-Site Measurement of Fat and Protein Contents in Milk Using Mobile NMR Technology

Robust and easy-to-use NMR sensor technology is proposed for accurate, on-site determination of fat and protein contents in milk. The two parameters are determined using fast consecutive ¹H and ³⁵Cl low-field NMR experiments on milk samples upon the 1:1 addition of a low-cost contrast solution. Reliable and accurate measurements are obtained without tedious calibrations and the need for extensive database information and may readily be conducted by non-experts in production site environments. This enables on-site application at farms or dairies, or use in laboratories harvesting significant reductions in costs and time per analysis as compared to wet-chemistry analysis. The performance is demonstrated for calibration samples, various supermarket milk products, and raw milk samples, of which some were analyzed directly in the milking room. To illustrate the wide application range, the supermarket milk products included both conventionally/organically produced, lactose-free milk, cow’s, sheep’s and goat’s milk, homogenized and unhomogenized milk, and a broad nutrient range (0.1–9% fat, 1–6% protein). Excellent agreement between NMR measurements and reference values, without corrections or changes in calibration for various products and during extensive periods of experiment conduction (4 months) demonstrates the robustness of the procedure and instrumentation. For the raw milk samples, correlations between NMR and IR, NMR and wet-chemistry, as well as IR and wet-chemistry results, show that NMR, in terms of accuracy, compares favorably with the other methods.