内含肽介导的鼠多瘤病毒样颗粒生产表达和纯化

鼠多瘤病毒样颗粒(VLPs)可由结构蛋白VP1自组装而成,可用于疫苗开发、基因治疗、药物传递和生物材料等方面.针对目前VP1生产中需要凝血酶去除谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签,生产成本较高、操作复杂的问题,利用内含肽(intein)自剪切的特征,将内含肽插入到VP1与GST标签之间进行融合表达,表达产物经亲和色谱纯化,并通过改变柱内pH值、温度诱导内含肽剪切,使VP1与GST-intein分离从而获得VP1蛋白,产量为4,mg/(L培养基).纯化的VP1可自组装成与天然鼠多瘤病毒样颗粒一致的VLPs.结果表明,内含肽介导鼠多瘤病毒样颗粒生产纯化流程简单易行,且无需凝血酶参与,大幅降低成本,为VLPs的高效制备奠定了基础.     

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。     

新型内含肽介导PHB系统表达纯化PoIFN-α的研究

为简化猪α干扰素蛋白（PoIFNα）的纯化步骤,以蛋白质自切割元件内含肽（Intein）替代蛋白酶,并以细菌自身产生的聚β-羟基丁酸酯（PHB）颗粒替代亲和配基,构建了新型内含肽介导PHB纯化PoIFNα的体系.结果显示,构建的基因工程大肠杆菌系统可成功实现PoIFNα的表达和纯化;φ（乳酸钠）=2.7%时,比较适宜工程菌的PHB累积;当诱导自切割反应温度为20℃,pH=6.5,反应时间为24~36 h时,可以实现内含肽C端高效自切割,纯化出的PoIFNα产量为20~30 mg/L.实验为重组猪α干扰素的工业化规模生产奠定了基础.     

LTE系统中一种切换自优化算法研究

综合研究了长期演进切换算法中切换参数值、用户移动速度和负载均衡机制对系统掉话率的影响,提出了一种结合用户移动速度和负载均衡机制的切换自优化算法。仿真结果表明,如果用户的移动速度一定,且切换迟滞因子和切换触发时延小于一定阀值时,增加其中一个或两个参数值会导致系统掉话率增加。如果切换控制参数一定,系统掉话率随用户的移动速度增加而增加。针对移动速度为低速、中速和高速的用户,分别采用4,3,2 dB的切换参数较为合适。如果用户速度和切换参数均相同,采用负载均衡机制后,系统的掉话率明显降低。经仿真验证,与传统切换算法相比,采用结合用户移动速度和负载均衡机制的切换自优化算法可以有效降低系统掉话率,并使系统整体性能得到提升。     

一种与胆固醇7,8位脱氢相关蛋白的表达研究

家蚕(Bombyx mori)的Nvd-Bm蛋白是一种与胆固醇7,8–脱氢酶相关的蛋白.根据NCBI中报道的家蚕中的胆固醇7,8–脱氢酶基因序列(Gen Bank登录号:AB232986.1),采用密码子优化及基因克隆技术,扩增获得胆固醇7,8–脱氢酶目标基因nvd-Bm,并构建了重组穿梭载体p PIC9K-nvd-Bm,通过电转化,成功构建了含有p PIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115异源真核表达工程菌株.经SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,含有p PIC9K-nvd-Bm的毕赤酵母GS115表达菌株能够成功表达目标蛋白,为胆固醇的7,8–脱氢产物即7–脱氢胆固醇的生物转化奠定了基础.     

密码子优化的H5亚型流感病毒HA基因重组质粒在哺乳动物细胞中的高效表达及其免疫原性的研究

为了提高流感病毒血凝素(HA)基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI-neo中,构建了真核表达质粒pCI-opti-HA.将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pCI-wt-HA分别转染Vero或293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和蛋白免疫印迹(WB)实验比较HA蛋白的表达量.将两种重组质粒免疫Balb/c小鼠,比较两者诱导的抗体产生水平.三次免疫后两周用强毒攻击,通过体温和体重变化评价两种重组质粒的免疫保护效果.IP-MA和WB实验结果表明:密码子优化后,HA蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高.酶联免疫吸附实验(ELISA)结果表明:小鼠免疫后密码子优化的重组质粒诱导的特异性抗体效价较高.攻毒试验结果表明:两种重组质粒均能够提供较好的保护.     

密码子优化的H5亚型流感病毒HA基因重组质粒在哺乳动物细胞中的高效表达及其免疫原性的研究

为了提高流感病毒血凝素（HA）基因的表达量及其免疫原性,按照哺乳动物偏爱密码子将A／Goose／HLJ／QFY／04（H5N1）流感病毒的血凝素基因进行优化改造,然后插入到真核表达载体pCI—neo中,构建了真核表达质粒pCI—opti—HA．将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pCI—wt—HA分别转染Vero或293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）和蛋白免疫印迹（WB）实验比较HA蛋白的表达量．将两种重组质粒免疫Balb／c小鼠,比较两者诱导的抗体产生水平．三次免疫后两周用强毒攻击,通过体温和体重变化评价两种重组质粒的免疫保护效果．IP—MA和WWWB实验结果表明：密码子优化后,HA蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平显著提高．酶联免疫吸附实验（ELISA）结果表明：小鼠免疫后密码子优化的重组质粒诱导的特异性抗体效价较高．攻毒试验结果表明：两种重组质粒均能够提供较好的保护．     

一种新的基于粒子群优化的自标定位置视觉定位算法

针对动态自标定的问题,提出了一种改进的基于粒子群优化(PSO)的自标定位置视觉定位算法.首先对本质矩阵进行奇异值分解,依据3个奇异值的特性在线生成目标函数,在进行动态自标定的同时,完成视觉伺服.算法抛弃了Chesi G方法中对初值选取极为敏感的基于梯度下降的方法,采用PSO动态优化摄像机内参数.该方法的主要优点是在线优化时对摄像机参数初值并不敏感,并克服了Chesi G方法中要求摄像机内参数不可变的限制,只需离线给出5个内参数的粗略范围.另外算法不需要物体精确的3维模型,只需8个空间固定点的坐标信息.大量实验结果表明,该算法应用于基于位置的视觉定位时比基于梯度的方法运算速度更快,且鲁棒性更强.     

一种优化COMET请求调度策略的应用研究

为提高服务器的应用性能和服务质量,针对目前较成熟的COMET技术框架都将重点放在如何改进服务器性能的问题,提出了一种优化COMET请求调度策略和应用架构。在应用中按请求的用户级别、信息类型等计算出请求优先级。根据优先级分配合适的推送技术,并通过在师生实时交流辅导系统中的应用,验证了优化COMET请求调度策略能够有效提高服务器的应用性能和实现服务器资源的合理分配。     

一种减小峰均功率比的PTS算法优化技术研究

研究了多载波通信系统峰均功率比(PAPR)抑制技术之一——部分传输序列(PTS)算法的优化技术.通过在传统多载波系统中加入PAPR门限比较判决模块,实现对多载波系统时域信号中较大PAPR值的抑制.传统PTS算法计算量大,不易实现.提出的比较判决优化技术将减小PTS数据处理的次数,使系统在PAPR抑制过程中的计算量明显减少.通过仿真证明,该优化算法在门限值合理设置时,可以使运算量减小近70%.该优化算法即使在子载波教较大的系统中,对系统的误码率性能有所优化,且不增加系统的带外辐射.     

重组酵母Saccharom yces cerevisiae蛋白激酶Sch9的分泌表达与活性鉴定

为了深入研究蛋白激酶Sch9的生物化学特性,在Pichia pastoris酵母KM71H菌种中分泌表达并纯化了重组Sch9蛋白.进一步通过体外磷酸化实验分析了重组Sch9蛋白的蛋白激酶活性.通过重组蛋白质工程的手段初步研究了Sch9蛋白的生物化学和酶学特性.     

重组真菌细胞色素P450nor2在酵母细胞中的表达

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种理想的真核蛋白表达系统．将真菌细胞色素P450nor2基因亚克隆到酵母表达载体pAUR123中,构建重组表达质粒pAUR-P450nor2并转化酿酒酵母AH22,经Aureobasidin A筛选和菌落PCR鉴定得到阳性克隆．SDS-PAGE分析证实：重组的真菌细胞色素P450nor2在酵母细胞中实现了高表达．     

醇酒酵母反义snoRNA一级结构的分析

对酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因组中发现和鉴定的41个反义snoRNA进行一级结构的分析表明：酿酒酵母snoRNA基因富含AT：41个反义snoRNA全都有boxC'和boxD'结构元素；根据反义snoRNA保守结构元素及反义序列的数目和位置的特点，将反义snoRNA分为5种结构类型，认为snoRNA具有两个主要的功能区；在snR57、snR59、snR71和snR75不具有指导甲基化反义序列的功能区中，发现有一段长10－12个核苷酸的序列与rRNA互补，为进一步研究反义snoRNA的结构与功能提供了重要线索。     

人类超氧化物歧化酶在酿酒酵母系统中的高效表达

超氧化物歧化酶(SOD)是一种在生物界广泛存在的抗氧化酶,在抗衰老、抗肿瘤、抗免疫疾病和电磁辐射上都起着重要的作用．对一从人类胎肝cDNA文库中筛到的SOD基因片段进行重组、克隆,并得到带有启动子PADHZ—GAPDH和终止子TADHI的高效稳定的酿酒酵母表达载体pHC11-hSOD．转化酿酒酵母DCO4后获得工程菌DCO4／pHC11-hSOD．表达产物经破壁后SDS-PAGE电泳检测为20ku的条带;酶活性测定结果表明发酵液有40万U／L的hSOD活性．此外,还研究了工程菌的发酵条件和hSOD产物的纯化方法．纯化产物在SDS-PAGE上和Superdex分子筛检测显示,所得产物的纯度已达95％以上．     

酿酒酵母金属硫蛋白的表达、纯化及活性检测

通过PCR从酿酒酵母基因组DNA上扩增得到酿酒酵母基因CUP1编码的金属硫蛋白序列.将其编码序列克隆到质粒pTWIN1构建重组表达质粒pTWIN1-MT,转化大肠杆菌感受态细胞ER2566.重组融合蛋白CBD-intein1-MT在IPTG的诱导下得到表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.用重组菌分别进行铜离子耐受...     

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)营养缺陷型的筛选及原生质体融合

本文采用营养缺陷型的互补进行了啤酒酵母原生质体融合产物的筛选。从DNA含量分析看,融合子多为三倍体,少数为四倍体,融合子的生长速度和酒精产率都比亲株高,种内原生质体融合率为1.21×10~(-4)。     

短小芽孢杆菌C-9葡聚糖内切酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)C-9中克隆得到葡聚糖内切酶基因,该基因包含1980 bp核苷酸,编码559个氨基酸,其N端有一个预测的29个氨基酸的信号肽序列;以YIp5质粒为骨架,构建rDNA介导的多拷贝整合载体,实现葡聚糖内切酶在酿酒酵母中的高效、稳定表达。与对照菌株相比,含有葡聚糖内切酶基因的重组酿酒酵母可以在以羧甲基纤维素为唯一碳源的培养基上生长。     

蓝藻光合基因psaC在酵母中的转化和表达

聚球蓝藻（Synechococcus sp.PCC 7002）的psaC是光系统I的FA/FB脱辅基蛋白基因,其分子量8.9kD蛋白中含有2个4Fe-4S中心,构建了psaC基因的表达载体pYES2-psaC,将表达载体转化到酵母（Saccharomyces cervisiae）中,Southern杂交证明psaC基因已被转化,诱导培养后的蛋白电泳显示psaC基因获得高效表达。     

酿酒酵母中心代谢网络动力学建模

以酿酒酵母中心代谢网络为研究对象进行代谢网络动力学模拟,将酶反应速率方程改写成普适的形式,模拟了以葡萄糖为碳源的一次生长代谢状态,计算得到了代谢网络达到稳态的代谢流分布以及全部代谢物浓度随时间变化的情况,并将模拟得到的代谢流分布与实验结果进行了比较,结果具有一致性.     

啤酒酵母和异常汉逊酵母属间原生质体融合

本文探索了用不可逆生化抑制剂(碘乙酸)抑制—亲株细胞某些酶活性的同时,利用两亲株细胞生理性差异作为啤洒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和异常汉逊酵母(Hansenula anomala)原生质体融合选择性标记的可行性。结果表明这一选择系统简便、可靠和适用。属间原生质体融合率为1.48-2.25×10~8。经菌落形态比较,碳化合物的发酵和同化,DNA含量测定,酯酶型分析,细胞核染色和自然核分离实验,结果表明从选择性培养基上筛选到的菌株分为三种类型:84.4％异常汉逊酵母型:10.4％啤酒酵母型:5.2％是真正核融合子型。本文还讨论了三种类型菌株出现的机理。