猴金属硫蛋白突变体(N4C, T27C, N4C/T27C)的构建、表达与结构性质研究

在哺乳动物金属硫蛋白的61或62个氨基酸残基中,有20个十分保守的Acysteines,它们通常结合7个二介后过渡金属离了如ZN2+和Cd2+[1,2]等,并形成两个结构域[3],在N-端B-donain[M(I)3-Cys9]的中,3个二价后过渡金属离子均以两上端基巯基和两个桥基巯的相同方式与肽链上的半胱氨酸配位,而在C-端的a-domain[M(I)-Cys11]配位方式分为两类;两上二价后过渡金属离子分别与3个桥基巯基和1个端基配位,另两个二价后过渡金属的配位方式与中的相似,金属硫蛋白在一级序列上最显著的特征是存在多个片段,其中X是非半胱氨酸氨基酸残基[1,7].     

三种金属硫蛋白动力学稳定性的理论研究

对三类金属硫蛋白（大鼠金属硫蛋白亚型Ⅱ,兔肝金属硫蛋白亚型Ⅰ和兔肝金属硫蛋白亚型Ⅱ）的单体和二聚体进行了水溶液条件下的分子动力学模拟。其中大鼠金属硫蛋白亚型Ⅱ的结构直接来自于晶体数据,兔肝金属硫蛋白亚型Ⅰ和Ⅱ的结构则通过同源蛋白模型搭建。动力学模拟的结果显示,这三种单体在水溶液中都具有相当大的柔性,柔性主要来源于柔性区的氨基酸残基。三类金属硫蛋白单体的动力学模拟均表明α结构域的动力学稳定性都要优于     

结合态含硫氨基酸的间接气相色谱法测定

生物体中含硫氨基酸[蛋氨酸(Met)、甲基半胱氨酸(CysCH_3)、半胱氨酸(CysH)、胱氨酸(Cys)]主要以结合态存在,参与生物体的重要生理功能与代谢,因此测定多肽及蛋白质中的氨基酸残基几乎是生命     

金属硫蛋白MT-2a与Cd(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)络合的电喷雾质谱表征

采用电喷雾质谱法(ESI-MS)研究金属硫蛋白(MT,存在α和β两种结构域)-2a与金属离子Cd和Cu的络合作用.MT-2a由反相色谱分离纯化制得,并以电喷雾质谱鉴别.通过ESI-MS考察MT-2a与不同量的Cd和Cu的络合,结果表明,Cd能够优先与MT的α结构域络合,形成M2+4S11结构,并且该络合过程存在着明显的协同效应;Cd与MT的β结构域的络合形式为M2+4S9,其呈现出明显的随机松散络合特性;Cu优先与MT的β结构域络合,其络合形式由Cu4逐渐过渡到更高结合态;在Cu含量较高的条件下,Cu与MT呈现出多种络合方式.     

基于快速定点突变研究含硒人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶1c-1c的催化活性

先将人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶1c-1c(hGSTZ1c-1c)中非催化中心的Cys-137,Cys-154,Cys-165和Cys-205突变为Ser,然后将催化中心14,15和17位的3个氨基酸残基突变为Cys,再利用半胱氨酸缺陷型大肠杆菌表达系统将其特定地转化为Sec,即把GPx的催化基团引入到hGSTZ1c-1c中,高效地获得了具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力的模拟酶.其中制备的3个含硒突变体15C,14C/15C和17C均显示出明显的GPx活力.对非含硒突变体性质研究发现,Ser-14或Ser-15任何一个残基发生突变都会导致hGSTZ1c-1c的GST活力几乎丧失,表明Ser-14和Ser-15在催化反应中发挥着重要作用,但前者主要参与底物结合,后者更侧重于催化.     

NRSF/REST蛋白结构域锌指9核磁共振溶液结构确定

NRSF/REST蛋白是神经元特异性基因表达的负调控因子. 其C端抑制结构域的C2H2型锌指结构域与共抑制蛋白CoREST相互作用能部分诱导NRSF/REST蛋白的负调控功能, 但具体的分子机制不清楚. 为了深入地研究该机制,利用核磁共振方法确定了该结构域C2H2锌指的溶液三维结构, 结果表明它具有典型的Cys2His2锌指三维结构, 揭示该结构域在NRSF/REST蛋白与DNA或RNA特异性识别上可能具有某些关键作用.     

金属硫蛋白异构体及亚型异构体的液相色谱分离与质谱鉴别

建立了金属硫蛋白(MT)异构体及亚型异构体的色谱分离与质谱鉴别方法。将金属硫蛋白混合物通过弱阴离子DEAE Sephadex A-25离子交换柱,结合离线电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对锌诱导金属硫蛋白的两个异构体MT-1和MT-2进行分离和检测;利用Sephadex G-25凝胶排阻色谱柱对得到的两个金属硫蛋白异构体进行脱盐;探索脱盐后的金属硫蛋白异构体在不同色谱条件下的C18反相色谱柱上的保留行为,进而实现各个亚型异构体的分离;通过在线电喷雾质谱检测实现了对金属硫蛋白各个亚型异构体的鉴别。结果表明,通过优化色谱条件,由离子交换色谱及凝胶排阻色谱得到的金属硫蛋白各亚型异构体在酸性条件下均得到了良好的分离,质谱检测结果与前人的文献报道结果一致。该方法可使金属硫蛋白各异构体均达到最佳的分离效果。     

金属硫蛋白家族内的结构域拼接

金属硫蛋白(Metallothioneins,MTs)由结构独立且功能明显区别的β,α两个结构域组成。神经生长抑制因子(NeuronalGrowthInhibitoryFactor,GIF)双名金属硫蛋白-Ⅲ(MT-Ⅲ),是神经系统中第一个被鉴定的具有神经元生长抑制功能的蛋白,而β－结构域为其功能结构域。为深入系统地研究MTs,尤其是GIF及其结构域的结构与功能,我们构建了金属硫蛋白家族内结构域拼接体βGIF-αMT-1(βⅢ-αⅠ)和βMT-1-αGIF(βⅠ-αⅢ):PCR扩增得各个结构域的cDNA序列,酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,经发酵、诱导表达、亲和层析、凝血酶切和进一步纯化,得率约为80mg蛋白/L菌液。测其电泳行为、氨基酸组成、质谱、金属巯基含量等,证明得到了目的蛋白。紫外吸收图谱和圆二色性图谱显示,结构域拼接体拥有金属硫蛋白家族成员的特征金属巯基簇结构域,初步功能实验表明,βⅢ－αⅠ也具有抑制神经元生长的功能。     

SARS冠状病毒E蛋白的结构研究及功能预测

结合生物信息学方法及分子模拟手段,选择较高准确度的方法,预测了SARSE蛋白的分子结构并探讨其潜在的生物学活性和功能.研究结果表明,SARSE蛋白跨膜区25个疏水的氨基酸形成α-螺旋结构,包埋于病毒外壳磷脂双分子层中;N端10个氨基酸残基位于膜外;C端41个残基则附着于磷脂双分子膜内侧.同时发现,C端由9个氨基酸组成的劈裂是一个可能的活性部位.对分子进行进一步静电势分析证实,E蛋白C端可能的活性部位具有较大的静电势,可能的活性残基具有最大电荷密度,故有较强的结合受体或与其它蛋白相互作用的能力.     

分子动力学模拟研究点突变(Met108→Leu108)对树胶醛糖结合蛋白与配体作用的影响

为了研究点突变(Met108→Leu108)对树胶醛糖结合蛋白(ABP)与配体结合能力的影响,对ABP、ABP结合树胶醛糖复合物及ABP结合半乳糖复合物以及它们各自的突变体分别进行60 ns的分子动力学模拟.模拟结果表明,108号残基突变前后,电子等排体的两个氨基酸残基,使蛋白与配体间的范德华相互作用发生明显变化,同时导致蛋白的内部运动也发生变化,进而影响蛋白与配体的相互作用.进一步分析表明,突变前后的蛋白构象变化都趋向于两个结构域张开,而与配体的结合可减缓张开程度.     

分子对接和动力学模拟提高嗜热蛋白酶PhpI的活力

通过分子对接和动力学模拟对嗜热蛋白酶的分子进行改造, 确定蛋白酶PH1704(PhpI)定点突变残基, 并通过分子生物学实验进行验证. 突变体K43C的蛋白酶活力提高了5.8倍. 分子动力学模拟结果表明, 经过8 ns的动力学模拟后, K43C突变体二级结构由野生型的S2片层(F11-E12-D13)变成环状结构. E12和K43均是活性位点的重要残基, 这种变化将导致活性位点的柔性增强, 有利于催化反应的发生.     

蜂毒肽类似物的合成和生物活性研究

Melittin(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH₂)是蜂毒中含26个氨基酸残基的多肽,具有抗菌和溶血等生物活性,是典型的阳离子抗菌肽.本文设计合成了蜂毒肽C端15残基肽片段(GLPALISWIKRKRQQ-NH₂)及其类似物(15残基).研究了Melittin及这些合成肽的抗菌活性、溶血活性、疏水性及二级结构.结果表明,合成的类似物的溶血活性明显降低,抗菌活性基本保留,且与其疏水性相关.类似物中与碱性氨基酸簇(KRKR)距离较远的残基的疏水性对其抗菌活性有较大的贡献.多肽溶血与抗菌机理不同.类似物的抗菌活性和溶血活性与其二级结构(α-螺旋结构)没有明显的相关性.     

细胞色素b5 S64X突变体对蛋白结构及稳定性的影响

为了深入了解细胞色素b₅(Cyt b₅)64位氨基酸残基(Ser64)对血红素辅基微环境及蛋白性质的影响,我们分别对Cyt b₅ Ser64进行了保守性突变(S64T)以及非保守性突变(S64K、S64N和S64H),均为亲水性氨基酸残基。对野生型细胞色素b₅及其突变体蛋白S64X(X：T,K,N或H)的热、酸、盐酸胍变性的稳定性研究表明：4个突变体蛋白的稳定性相对于野生型都大大降低了;CD光谱表明,细胞色素b₅ S64X突变体中的α-螺旋明显减少,芳香性氨基酸残基所处的肽链结构受到了影响;盐酸胍变性荧光光谱表明,Trp22周围的蛋白肽链受到了影响,Trp22暴露于水溶液的程度加大。我们认为Ser64不仅对血红素辅基有稳定作用,同时还对维持蛋白Core 1中的第5个α-螺旋结构有重要的作用,在64位引入其他氨基酸残基影响了第5个α-螺旋的结构,并通过蛋白肽链的相互作用,使得Trp22所在的Core 2结构也受到了较为明显的扰动。     

过渡金属催化的硫酯的交叉偶联反应研究进展

硫酯在医药、农药、香精香料、材料等领域应用广泛,可从羧酸衍生得到,羧酸在自然界寻常可见、结构丰富.硫酯C(O)—S键能轻易和低价过渡金属发生氧化加成生成C(O)—M—S,该物种在不脱羰或脱羰情况下可以和亲核试剂反应构建碳碳键.近二十年来,人们广泛研究了过渡金属催化的硫酯的交叉偶联反应,这为从羧酸出发构筑C—C键提供了可供选择的有效方案.本综述按照过渡金属种类,依次对钯、镍、铜、铑等过渡金属催化的硫酯的交叉偶联反应进行了总结和讨论,综述了该类反应在天然产物、药物分子合成及其后期转化中的应用.同时关注了近些年报道的硫酯的不对称交叉偶联反应,以及硫酯的交叉偶联反应在串联反应和官能团转化方面的应用.     

硫化氢信号分子与L-乳酸脱氢酶蛋白相互作用机制的研究

硫化氢(H_2S)作为信号分子与目标蛋白相互作用而实现信号传导机制的研究一直是研究热点。本研究以L-乳酸脱氢酶为目标蛋白,选用3种H_2S供体试剂(NaHS、Na_2S、PS),采用分子荧光实时监测L-乳酸脱氢酶活性变化,研究H_2S与目标蛋白的相互作用。SDS-PAGE电泳结果显示,H_2S不是通过形成二硫键/三硫键的方式与L-乳酸脱氢酶蛋白相互作用;圆二色谱结果表明,L-乳酸脱氢酶的二级结构发生变化,提示H_2S可能存在半胱氨酸巯基衍生能力,以硫烷硫存在的PS具有最强的巯基作用力;MALDI-TOF-MS/MS分析结果表明,L-乳酸脱氢酶蛋白中部分半胱氨酸巯基位点发生了硫烷化,进一步揭示了H_2S是通过与活性半胱氨酸巯基位点硫烷化的方式与L-乳酸脱氢酶发生作用。     

大鼠肝脏金属硫蛋白的分离纯化和金属硫蛋白亚型-Ⅱα结构域片段的制备及其核磁共振鉴定

Wistar雄性大鼠经腹腔注射CdCl_2诱导其肝脏合成金属硫蛋白。取鼠肝,先经匀浆、热变性、乙醇-氯仿萃取、丙酮沉淀等步骤,后由Sephadex G-75、DEAE-52柱层析,得金属硫蛋白的两亚型Ⅰ和Ⅱ。经原子吸收光谱测定每蛋白分子含有5个镉和2个锌。用枯草杆菌酶割法制备并分离了金属硫蛋白亚型Ⅱ的α结构域片段。还用NMR研究了金属硫蛋白的两个亚型及所得的α结构域片段。     

可同时比色检测硫离子和高半胱氨酸/半胱氨酸的化学探针的合成及应用

合成了一个能同时检测硫离子(S2-)和高半胱氨酸/半胱氨酸(Hcy/Cys)的化学探针1,采用核磁共振波谱(NMR)、高分辨质谱(HRMS)、元素分析和傅里叶换红外光谱(FTIR)等表征了其分子结构,并通过高效液相色谱、质谱以及核磁滴定氢谱实验研究了探针1检测S2-和Hcy/Cys的机理.实验结果表明,探针1能同时对S2-和Hcy/Cys进行快速、高敏感性和选择性识别,并且是通过硫醇亲核反应识别的.在Tris-HCl缓冲溶液[10 mmol/L,p H=7.40,50%(体积分数)乙醇]中,探针1对S2-于552 nm处表现了显著的吸收强度增强并伴随溶液颜色由无色变为紫红色;对Hcy/Cys于552 nm处表现了特异的荧光增强,而对Cys的检测还可见溶液颜色由无色变为酒红色,据此制备了负载探针1的滤纸传感器用于比色检测S2-和Cys.此外,将探针1用于人血清的加标回收率测定,获得了较好的结果.     

一种基于罗丹明类似物的Cys近红外荧光探针

基于罗丹明类似物作为荧光团合成了一例新型半胱氨酸(Cys)近红外荧光探针CS-Cys.该探针能特异性识别Cys,其他含巯基氨基酸不与探针响应,响应机理为:Cys与CS-Cys分子中的丙烯酸酯发生共轭加成-环化反应,进而羟基裸露并释放出荧光.通过对CS-Cys与Cys在不同pH环境中反应后的荧光变化进行研究,发现通过改变溶液pH值可调节给电子基的供电子能力和荧光团ICT过程,从而使荧光激发波长和发射波长达到近红外区域.     

金属硫蛋白聚合中阳离子作用机制的研究

蛋白质数据库 (ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ,ＰＤＢ)中有大鼠及几个其它种属动物的金属硫蛋白的结构 ,但其中只有大鼠金属硫蛋白亚型Ⅱ的晶体结构是完整的单体［１］,核磁共振溶液构象均只是金属硫蛋白被蛋白酶降解后的单一α或 β结构域．从大鼠金属硫蛋白亚型Ⅱ的晶体结构的堆积形式上看 ,二聚体可能是晶体生长过程中最小的堆积单元 ,因此Ｒｏｂｂｉｎｓ和Ｓｔｏｕｔ等人认为 ,大鼠金属硫蛋白亚型Ⅱ分子在溶液中也是以二聚体形式存在［２］．在晶体生长过程中 ,蛋白质在溶液中的构象会直接影响晶体的堆积．因此 ,对于大鼠金属硫蛋白…     

嗜热蛋白酶PH1704别构中心量子化学计算与突变体动力学简

通过量子化学计算,确定嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的PH1704蛋白酶别构位点的关键残基为Arg113,Tyr120和Asn129. 其中,Arg113及Asn129与别构抑制剂结合,参与别构调控. Tyr120残基位于亚基交界面附近,并与亲核残基Cys100之间以氢键相连,可通过影响亚基聚合来影响酶的亲核催化. DJ-1超家族的4种构建蛋白的结构显示,120位点位于亚基交界面处,影响亚基的聚合,进而影响蛋白酶的活力,并间接参与别构调控. 分子生物学实验显示,突变体R113T/Y120P/N129D的kcat/km(L·μmol-1·min-1)值是野生型kcat/km值的6倍,h系数由野生型的0.86转变为1.3,负协同效应消失. 113和129位点处阴离子别构剂脱离,从而破坏113,120和129位点间的封闭环结构,使AC交界面α7螺旋(124~129,524~529)间聚合度增强;120位点残基由Tyr转变为Pro,与Cys100间氢键断裂,亲核进攻的阻力减小,从而使酶活力提高,别构负调控消失.