蛋白质组的分离与分析及其应用进展

蛋白质组学正在成为分析化学研究的热点。本文综述了蛋白质组的高通量分离和分析技术，包括双向凝胶电泳、生物质谱、二维谱新技术和蛋白芯片的发展现状以及蛋白质组学的最新应用进展，并展望了分析化学在蛋白质组学领域今后的发展。     

优化分离与鉴定蓝斑背肛海兔口腔神经节蛋白质组

采用双向凝胶电泳技术优化分离蓝斑背肛海兔(Notarcus leachii cirrosus Stimpson, NLCS)口腔神经节(Buccal Ganglion, BG)蛋白质组, 并获得约300个蛋白质斑点. 用组合基质辅助激光解吸电离化飞行时间(MALDI-TOF)质谱技术和胶内酶解技术测定BG蛋白质组中的96个蛋白质斑点的肽指纹(Peptide mass fingerprint, PMF)图谱. 经数据库检索与比对后, 发现96种蛋白质中仅有4种蛋白质可获得较高的匹配率, 它们分别是微管蛋白(Tubulin)、 肌动蛋白(Actin)和两个1,5-二磷酸核酮糖-羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Ribulose), 均属于神经细胞骨架蛋白质; 同时还发现一种交配信号肽前体(Peptide mating pheromone precursor). 利用LOCtrees软件和分类法对56种蛋白质进行亚细胞定位与分类.     

镧对肝细胞株7701的增殖和对蛋白质表达的影响

采用MTT法考察了La3 在2×10-4～4×10-7 mol·L-1浓度范围内对体外培养的人正常肝细胞株7701的生长和增殖的影响及其对浓度的依赖关系.结果表明,低浓度的La3 对细胞有明显的促增殖作用,而高浓度的La3 对细胞的生长表现抑制作用.为探讨促增殖的细胞是否正常,利用双向凝胶电泳技术,对La3 诱导增殖的细胞和对照组正常细胞进行蛋白质分离和分析,发现两组细胞蛋白质的表达存在着明显的差异,表示在稀土促进增殖下的细胞可能并非正常,并讨论了La3 促进细胞增殖的可能机制及其过程.     

蛋白质组学技术筛选与鉴定癫痫疾病的差异蛋白质

应用蛋白质组学双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)和质谱技术, 定量分析和鉴定了癫痫组(n=3)和正常组(n=3)脑组织的差异表达蛋白, 以从蛋白质水平上揭示癫痫病的发机制. 结果表明, 凝胶图谱可辨识2500~3000个蛋白点, 对21个显著差异表达蛋白点进行质谱鉴定和SwissProt数据库检索, 得到17个癫痫差异蛋白, 其中2个蛋白在癫痫组织中表达上调, 15个蛋白表达下调. 部分蛋白与癫痫的关系属首次报道. 这些蛋白与癫痫的发生发展相关, 可能成为癫痫的分子标志物和药物治疗的靶向蛋白.     

K-Means聚类分析法筛选柠檬香茅茎叶差异蛋白及鉴定

柠檬香茅含有大量的香茅精油,运用十分广泛,然而其茎、叶的精油含量却相差悬殊。 为探索柠檬香茅精油代谢相关的蛋白途径,本文对柠檬香茅旗叶、成熟叶及茎秆等材料进行精油含量、总蛋白含量测定及双向凝胶电泳(2-DE)表达谱分析,运用k-means聚类分析方法对2-DE电泳中差异蛋白斑点的丰度、等电点和相对分子质量进行聚类分析和讨论,结果表明,旗叶和茎秆上调表达的蛋白质斑点的聚类对于相对分子质量变化敏感,成熟叶上调表达蛋白质斑点对于丰度的变化较为敏感。 预测了精油代谢功能相关的蛋白质斑点15个,挖取预测蛋白质斑点通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)成功鉴定了9个蛋白质。 本研究为柠檬香茅精油的蛋白代谢途径提供新的基础信息及研究思路。     

表达蛋白质质谱分析

对基因编码的蛋白质进行系统分析可以为注释基因组信息和研究疾病发生机理提供参考.质谱因其高通量、高灵敏度和高精度等特点成为蛋白质表达谱研究的核心技术.过去10年,质谱技术的发展大大促进了蛋白质表达谱的研究.本文综述了蛋白质表达谱的定性和定量研究进展,并展望了进一步的研究方向.     

Ⅱ型糖尿病大鼠神经视网膜组织中差异蛋白质分析

以高脂饮食联合小剂量链脲菌素(Streptozotocin, STZ ) 注射方法诱导大鼠II型糖尿病 (T2DM) 模型为研究对象, 采用比较蛋白质组学技术鉴定和分析早期糖尿病神经视网膜差异表达蛋白.通过联用液氮内研磨、冰浴超声、高速离心提取全蛋白技术,提取每只大鼠神经视网膜全蛋白质总量约900 μg.采用双向凝胶电泳(2-DE) 分离技术,获得2500个以上可辩认的蛋白质斑点.通过蛋白质组学比对技术筛选出糖尿病状态下神经视网膜差异表达蛋白,用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱 (MALDI-TOF- MS/MS) 和肽质量指纹图谱 (PMF) 鉴定出20个差异蛋白点.按照Gene Ontology (GO)分类体系,对差异蛋白归类分析,揭示其亚细胞定位和分子功能.应用Pathway Studio软件对差异表达蛋白的生物学意义进行分析,认为凋亡是早期糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR) 重要的细胞事件;AnnexinΙ、CRYAB、mtHsp70蛋白是与病理过程相关的关键蛋白,对研究DR致病机制有重要意义.     

不稳定性心绞痛血瘀证的血浆蛋白质组学研究

为了寻找冠心病不稳定性心绞痛血瘀证血浆差异表达蛋白, 探索冠心病不稳定性心绞痛血瘀证的蛋白质组学特点. 采用差异凝胶双向电泳和质谱联用技术对12例冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者和12例健康人血浆进行比较研究. 初步发现了Fibrinogen β chain, Fibrinogen γ chain, α1-Antitrypsin, Haptoglobin β chain, Haptoglobin α2 chain在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者中高表达, ApoA-IV, ApoA-I, Transthyretin, ApoJ在冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者中低表达. 差异表达蛋白根据功能可分为以下三类: (1)急性时相反应负相蛋白; (2)载脂蛋白; (3)凝血相关蛋白. 冠心病不稳定性心绞痛血瘀证可能与炎症反应、脂代谢紊乱以及凝血功能异常相关.     

非小细胞肺癌患者尿中Exosomes蛋白质组的差异表达分析

除血浆之外,尿液是另一种寻找潜在生物标志物的重要生物材料。本研究以200000×g超速离心法分离正常人和非小细胞肺癌(NSCLC)患者尿液中的Exosomes,运用1DSDS-PAGE对Exosomes蛋白质组进行分组,从电泳胶上切取正常组和疾病组的20～31kDa条带,胰蛋白酶酶解后,进行HPLC-CHIP-MS/MS分析,并通过UniProtKB/SWISS-PORT数据库搜索鉴定了24种蛋白质,其中在NSCLC患者尿液Exosomes蛋白质组中发现了8种差异表达蛋白,包括免疫球蛋白κ的3个片段、2种Ras相关蛋白、谷胱甘肽S转移酶A2、血清淀粉样P成分前体和磷脂酰乙醇胺结合蛋白1。     

电离辐射诱导T淋巴细胞的差异蛋白质组学研究

应用电离辐射诱导人类T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株, 再经二维凝胶电泳分离不同照射剂量的细胞总蛋白, 研究电离辐射诱导的人类T淋巴细胞白血病细胞蛋白的差异表达. 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行处理, 得到肽质量指纹(PMF)图谱, 确认6个差异表达蛋白点.     

毛细管电泳检测肺癌及癌旁正常组织蛋白质混合物差异

以建立的毛细管电泳(CE)-激光诱导荧光(LIF)检测蛋白质的方法对提取肺癌及癌旁正常组织蛋白质混合物(变 性/活性)差异进行检测. 采用异硫氰酸荧光素(FITC)为衍生剂, 电泳缓冲液为1×TBE (TBE为Tris-硼酸-EDTA, 变性电泳pH 10.0, 活性电泳为pH 8.3且含有2 mg/L考马斯亮蓝), 分离电压15 kV, 柱温15 ℃, 电动进样(10 kV×10 s), 激发波长/发射波长＝488/520 nm检测时, 肺癌及癌旁正常组织蛋白质混合物样品得到较好分离且有明显差异. 与目前常用蛋白分析方法: 变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及活性蓝绿温和胶电泳(BN-PAGE)进行比较. BN-PAGE结果显示肺癌组织相比正常组织有较明显蛋白种类差异|SDS-PAGE结果表明一些蛋白质表达量差异也是肺癌及癌旁正常组织的显著差别, 且主要集中在20～116 kDa. CE-LIF检测结果与PAGE结果大致相同, 且CE-LIF检测蛋白质的灵敏度高于PAGE, 能更准确反映肺癌及癌旁正常组织的蛋白质差异. 结论是CE-LIF可用于蛋白质差异检测, 时间短, 效果较好, 对活性蛋白质进行分析体现了其优点: 可提供较强的动力——电压, 及强动力下良好的温度稳定性.     

钝顶螺旋藻Spirulina platensis两种不同形态藻丝体的光合作用和蛋白质差异表达分析

从钝顶螺旋藻Spirulina platensis中分离纯化获得了螺旋形和直线形两种不同形态的藻丝体. 通过对二者光合作用的研究发现, 螺旋形藻丝体具有较高的光饱和光合作用速率(P_m^Chla)和光饱和点, 比直线形藻丝体更能适应较高光强的环境; 而直线形藻丝体具有较低的光补偿点, 能在更低的光强下进行光合作用. 通过双向凝胶电泳对两种不同形态藻丝体的总蛋白进行比较分析, 从中找出了9个差异表达的蛋白点. 应用基质辅助激光解吸电离质谱对差异表达的蛋白质点进行鉴定和数据库检索, 结果表明, 3个蛋白与肽聚糖代谢有关, 2个蛋白与光合作用有关, 1个蛋白与细胞分裂调控相关, 1个蛋白为外膜通道蛋白, 2个蛋白为功能未知的假想蛋白.     

Characterization of Unique and Differentially Expressed Proteins in Anthracnose-Tolerant Florida Hybrid Bunch Grapes

Anthracnose is a major disease in Florida hybrid bunch grapes, caused by a fungus viz. Elsinoe ampelina. Florida hybrid bunch grapes are grown in southeastern USA for their superior wine characteristics. However, the effect of anthracnose on grape productivity and wine quality is a major concern to grape growers. Our research is aimed at determining biochemical basis of anthracnose tolerance in Florida hybrid bunch grape. Leaf samples were collected from the plants infected with E. ampelina at different periods and analyzed for differential protein expression using high throughput two-dimensional gel electrophoresis. Among the 32 differentially expressed leaf proteins, two were uniquely expressed in tolerant genotypes in response to E. ampelina infection. These proteins were identified as mitochondrial adenosine triphosphate synthase and glutamine synthetase, which are known to play a major role in carbohydrate metabolism and defense. Several proteins including ribulose 1-5 bisphosphate-carboxylase involved in photosynthesis were found to be suppressed in susceptible genotypes compared to tolerant genotypes following E. ampelina infection. The results indicate that the anthracnose-tolerant genotypes have the ability to up-regulate and induce new proteins upon infection to defend the invasion of the pathogen as well as maintain the normal regulatory processes.     

Proteomics‐based Characterization of Protein Complexes from Human Pancreatic Cancer Cell Line

To develop an economical and feasible approach to probe protein complexes, differential centrifugation and three‐dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) were performed to separate protein complexes from the cell lysate of human pancreatic cancer cell line, SW1990, followed by mass spectrometric identification. Four macromolecular protein complexes were separated and identified unambiguously.     

Differential Proteomic Analysis of Neonatal Cardiomyocytes in Response to β-Adrenergic Receptor Stimulation

β-Adrenoceptors(β-ARs) play a critical role in regulating cardiac functions under both physiological and pathological conditions. To further explore the mechanisms through whichβ-ARs perform its actions, proteomic approaches were adopted to study the global protein patterns in cultured neonatal rat cardiomyocytes exposed to isoproterenol(ISO). A modified method, "Mirror Images in One Gel", was used to improve the reproducibility and resolution power of two-dimensional electrophoresis. A 2-DE map with a good reproducibility was obtained in which 1281 ± 70spots were detected and about 1191 e 54 spots were matched, with an average matching rate of 92. 9%. Nine proteins with significant changes were identified by using peptide mass fingerprinting(PMF) data obtained via MALDI-MS.     

液相等电聚焦结合双向凝胶电泳分离碱性蛋白

在蛋白组学研究中, 经典的双向凝胶电泳法(2-DE)对碱性蛋白及低丰度蛋白的分离存在技术障碍, 但预分离技术的应用可弥补其缺陷. 液相等电聚焦可有效地分离富集复杂蛋白样品. 碱性胶条用于2-DE可极大地提高蛋白上样量和凝胶分辨率. 将上述两种技术相结合用于碱性蛋白质和低丰度蛋白质的分离鉴定, 可使碱端区域双向凝胶图谱质量显著提高, 蛋白点更清晰且点数增多, 质谱鉴定确信度提高, 碱性蛋白和低丰度蛋白质谱鉴定成功率提高, 对于蛋白组学研究具有一定的意义.