胰高血糖素样肽-1受体激动剂功能性报告基因分析系统的构建

用大鼠胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)基因转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的CH0细胞,成功地构建了基于G蛋白偶联受体信号传导途径的CHO/EGFP/GLP-1R检测细胞系.该细胞系能功能性表达GLP-1R并且能通过cAMP偶联的EGFP报告基因的表达评价GLP-1R激动剂的活性.利用该细胞系本文进一步对5种GLP-1与金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)不同形式连接的融合蛋白进行了体外活性评价.结果表明,5种融合蛋白的活性均低于天然的GLP-1,将GLP-1融合在SPA的N端与C端融合相比,能显著的提高其生物活性.在融合蛋白之问加入不同长度的重复序列(GGGGS),有助于提高其活性,但间隔序列的长短对活性没有显著的影响.以上结果表明,利用CHO/EGFP/GLP-1R细胞系,能够对GLP-1及其类似物的体外活性进行定性和定量的分析,为筛选和开发长效GLP-1类似物奠定了方法学基础.     

中草药中胰高血糖素受体拮抗剂的高通量细胞筛选

为筛选胰高血糖素受体拮抗剂，建立了一种高通量筛选胰高血糖素受体拮抗剂的细胞模型.利用PCR方法扩增得到人的胰高血糖素受体 cDNA，并连接到哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1上，构成质粒h glucagons-R/pCDNA3.1，将这种质粒与报告基因质粒(3×CRE/3×MRE/SRE-LUC)共转染到HEK293细胞，通过G418筛选，建立稳定的人胰高血糖素受体拮抗剂筛选细胞株.利用胰高血糖素受体内源激动剂探索和优化了筛选条件，筛选方法合理， Z′因子大于0.6，系统稳定，符合胰高血糖素受体拮抗剂的高通量筛选的要求.     

人胰高血糖素样肽-1串联体的克隆及其表达

为大量获取人胰高血糖素样肽-1,利用基因串联的方法构建了人胰高血糖素样肽-1的一组串联体.将化学合成的人胰高血糖素样肽-1（human glucagon like peptide-1, hGLP-1）cDNA基因插入质粒载体pET-32a(⁺)中,构建成硫氧还蛋白（thioredoxin）及六聚组氨酸（hexahistidine）与rhGLP-1的融合表达载体pET32-GLP-1.在此基础上将该融合基因序列进行同向串联,获得二串和三串的表达载体pET32-GLP-1-2 和pET32-GLP-1-3.将该三种表达载体转化大肠杆菌BLR(DE3)后获得相应的基因工程菌.结果表明：三种基因工程菌经发酵和IPTG诱导后均正确表达目的蛋白,目的蛋白表达量随着基因串数的增加而得到一定提高,重组蛋白经分离纯化后进行生物学活性测试具有明显的降低血糖浓度作用.     

胰高血糖素样肽1受体N端片段与exendin-4的亲和位点分析

通过易错PCR(epPCR)方法建立了一个鼠肺的胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)N端片段的噬菌体随机突变展示肽库.根据筛选出的突变体来分析突变后胰高血糖素样肽1受体N端片段(nGLP-1R)与exendin-4结合活性.实验结果显示:保守的半胱氨酸C26发生突变后并未引起nGLP-1R与其配体exendin-4结合能力的改变,第101位和108位氨基酸是nGLP-1R与exendin-4结合的潜在位点.     

人胰高血糖素样肽-1突变体的生物学活性研究

为了解基因工程制备的重组人胰高血糖素样肽-1突变体（^2Gly-hGLP-1）的生物学活性，首先将重组hGLP-1和^2Gly-hGLP-1分别与二肽酰基肽酶Ⅳ（DPPⅣ）在37℃共同孵育．结果表明，与DPPⅣ孵育4h后，大于90％的hGLP-1被DPPⅣ降解，而85％以上的^2Gly-hGLP-1保持完整，可明显抵抗DPPⅣ的降解．之后将二者分别以12nmol／kg剂量腹腔注射Wistar大鼠，在不同时间点取血，测定血糖与血浆胰岛素水平．与对照组相比，腹腔注射重组hGLP-1和^2Gly-hGLP-1（12nmol／kg）可显著降低血浆葡萄糖水平，并提高血浆胰岛素水平（P〈0．001），且在15．30min时间点，^2Gly-hGLP-1的效应高于hGLP-1（P〈0．05）．     

Exendin-4治疗糖尿病的研究进展

糖尿病还伴随着诸多并发症,现已成为仅次于恶性肿瘤和心血管疾病之后的第三大健康杀手。本文介绍了一种治疗糖尿病的新药物Exendin-4,对其在结构上的特点以及药理活性进行了综述。     

2型糖尿病患者血清肿瘤标志物CA19-9、CEA与HbA1c、血糖、C肽及脂类的相关分析

目的:评价2型糖尿病患者血清肿瘤标志物CA19-9、CEA质量浓度与糖化血红蛋白(HbA1c)、血糖、C肽、脂类等因素的相关性.方法:随机选取确诊的2型糖尿病患者共202例作为糖尿病组,选取同时期健康体检的健康人202例作为对照组.收集两组CA19-9、CEA及HbA1c、空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hPG)、空腹C肽(C₀)、餐后2hC肽(C₂)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TCHOL)、甘油三酯(TG)的检测结果并进行相关性分析.结果:(1)糖尿病组CA19-9、CEA、FBG、HbA1c、TG高于对照组,HDL低于对照组(P<0.05).(2)糖尿病组Spearman相关分析结果显示CA19-9、CEA与HbA1c、FBG呈正相关(P<0.05);CEA与2hPG呈正相关,与C₀、C₂呈负相关(P<0.05).(3)多元逐步回归分析结果显示HbA1c和C₀是影响血清CA19-9水平的因素, HbA1c是影响血清CEA...     

肌醇需求酶1(IRE1)激酶抑制剂高通量筛选模型的建立

运用昆虫蛋白表达体系成功表达纯化得到高纯度的内质网单次跨膜蛋白肌醇需求酶1(IRE1)细胞质区域段,并建立基于均相时间分辨荧光(HTRF,Homogeneous Time-resolved Fluorescence)原理的激酶活性检测体系,优化激酶抑制剂的高通量筛选模型.该模型Z’因子等于0.58,CV值等于7.5％,符合高通量筛选要求,表明高通量筛选模型建立成功.本工作为进一步发现IRE1激酶抑制剂及其后续研究工作奠定坚实基础.     

2型糖尿病患者血糖波动与血清25-羟维生素D水平的相关性研究

目的 探讨2型糖尿病(T2DM)患者血糖波动与血清25-羟维生素D(25(OH)D)水平的相关性.方法 应用动态血糖监测系统(CGMS)对110例T2DM患者进行72 h连续血糖监测,计算平均血糖波动幅度(MAGE),根据MAGE值分为血糖平稳组(c(MAGE)<6.3 mmol/L)和血糖波动组(c(MAGE)≥6....     

肉芝软珊瑚素全合成的研究——Ⅱ.6-甲基-8-三甲硅氧基-6-烯-2-酮-1-辛酸乙酯的合成

报道肉芝软珊瑚素的重要中间体6-甲基-8-三甲硅氧基-6-烯-2-酮-1-辛酸乙酯的合成。该中间体是肉芝软珊瑚素分子中的C_9-C_(17)片段。     

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂高通量筛选模型的建立和应用

 为了建立体外蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2抑制剂的高通量筛选模型,筛选潜在的SHP2抑制剂,通过应用大肠杆菌系统克隆表达GST-SHP2 融合蛋白,经过GST-Sepharose 亲和层析分离得到纯化的GST-SHP2 蛋白,建立384 孔板的高通量筛选模型,对48000个有明确结构的小分子化合物进行体外筛选,筛选出75个活性化合物对SHP2的抑制作用大于50%,确定3个化合物具有较高的抑制活性。该筛选模型灵敏、稳定,对SHP2抑制剂药物研发打下了基础。     

MC1R天然拮抗剂的高通量初步筛选

为了寻找高效稳定的黑色素皮质激素受体1(melanocortin 1 receptor, MC1R)的拮抗剂,利用作者前期工作中建立的高通量筛选方法对 1 000种中草药提取物进行了筛选,并检测了这些提取物对小鼠B16-F1细胞系黑色素生成量的影响.结果表明,补骨脂等10种粗提物具有拮抗促黑激素（MSH）激活MC1R的作用.其中,补骨脂、破茎松萝、桑根和太白树粗提物能明显降低B16-F1细胞的产黑色素能力,但其机制有所不同,补骨脂主要作用于MSH对C1R的激活过程,而其余3种提取物基本上直接作用于cAMP通路.本实验为利用上述中草药调控皮肤细胞中的黑色素生成提供了初步线索.     

Generation of transgenic cucumbers with expression of a ten-tandem repeat long-acting GLP-1 analogue and their biological function on diabetic rats

Glucagon-like peptide-1 （GLP-1） is a 30-amino acid peptide hormone, which has the regulatory function of stimulating the secretion of insulin to balance blood glucose levels. In this study, marker-free expression vector pX6 with a fusion gene of ten tandem repeated GLP-1 analog （[Ser8, Gln26 and Asp34]-GLP-1） genes was constructed and transformed into cucumbers by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method. Four transgenic lines were obtained by PCR and Southern blotting analysis and two transgenic lines successfully expressed the fusion protein （named GLP-T）, which was revealed by Western blotting analysis. The biological activity test results showed that the serum glucose level of diabetic rats was significantly decreased after oral administration of the fusion protein GLP-T extracted from the transgenic cucumber fruitage. These results suggest that this may provide a brand-new strategy to prevent and cure the diabetes with no pain.     

高糖高脂饲料诱导的小型猪肥胖模型

目的 探讨高脂高糖饲料对巴马小型猪脂肪分布与血液生化指标的影响。方法 巴马小型猪14头,实验组8头,为本实验室培育的2型糖尿病易感小型猪,饲喂高脂高糖饲料30周;对照组6头饲喂正常饲料。30周后测定体型系数、CT扫描脂肪含量、采集血液检测生化指标,比较实验组与对照组的差异。结果 高脂高糖饲料饲喂30周后实验组动物与对照组动物在体质量、体质指数(BMI)、脂肪总含量差异显著(P<0.05),内脏脂肪含量差异极显著(P<0.01);血液生化指标中胰岛素、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三脂与对照组相比差异极为显著(P<0.01),低密脂蛋白胆固醇与对照组相比差异显著(P<0.05)。此外,实验组巴马小型猪血清蛋白、肌酸酐与对照组差异显著(P<0.05);尿酸、尿素与对照组差异极显著(P<0.01),显示实验组小型猪呈现肾损伤。结论 高脂高糖饮食能够引起巴马小型猪脂肪堆积,内脏脂肪堆积尤为明显,血液生化指标呈高脂血症伴有肾功能的损伤。     

新型呼肠病毒S1基因与宿主细胞相互作用的初步研究

摘要 目的 筛选出新型呼肠病毒S1基因和宿主相互作用的关键区段,为后续的宿主受体蛋白筛选工作提供可靠的基础。 方法 将编码全长S1基因,以及N端和C端阅读框分别克隆入真核表达载体pIRSE2-EGFP,转染敏感细胞株鼠成纤维细胞（L929）和人宫颈癌细胞（Hela）后,通过荧光报告基因EGFP的表达分析,筛选出S1基因与宿主细胞相互作用时起决定性影响的区段。 结果 同等量的3种真核表达质粒在单独转染L929时,pGSN质粒转染后荧光表达量最大,pGSC质粒转染后荧光表达量最小。 不同比例混合的pGS与pGSN进行共转染时,pGSN在转染质粒中的比例越高,荧光表达量也越高。 在Hela细胞中的转染结果与L929相同。 结论 新型呼肠病毒R4株的S1基因N端阅读框编码区（62-406bp）在S1基因转染时起关键作用。     

糖尿病患者血栓前状态研究

采用流式细胞仪、ELISA法、全自动血凝分析仪,检测糖尿病患者血小板表面P-选择素(CD62P)的表达、血浆组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、抑制剂(PAI-1),以及凝血4项,即血浆纤维蛋白原(Fib)水平、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)。结果显示,糖尿病组血小板表面CD62P的表达、血浆PAI-1、Fib 3项指标均较正常组增高(P<0.05),而t-PA水平较正常组降低(P<0.05);糖尿病组APTT、PT及TT时间明显缩短(P<0.05);糖尿病伴血管病变组血小板表面CD62P的表达、血浆PAI-1、Fib 3项指标均较不伴血管病变组增高(P<0.05);糖尿病伴血管病变组APTT及TT较不伴血管病变组明显缩短(P<0.05);糖尿病伴血管病变组血浆t-PA水平、PT与不伴血管病变组指标比较没有显著性差异(P>0.05)。研究表明,糖尿病及糖尿病伴血管病变患者血小板活化、凝血功能增强、纤溶功能减退,存在明显的血栓前状态;测定血小板表面CD62P的表达、血浆t-PA、PAI-1,以及凝血4项,即血浆Fib水平、APTT、PT、TT等有助于早期发现血栓前状态及血管病变,并可以指导临床早期干预治疗。     

列线图预测中国老年人2型糖尿病患病风险

为建立国内老年人2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患病风险的预测模型并加以验证,基于瑞慈医疗集团在中国建立的一个健康筛查项目的数据库,纳入了24 804名基线检查时无T2DM的老年人,随访时间为3年和5年。以7∶3的比例分成训练集和验证集,单变量和多变量Cox回归分析用于确定独立危险因素,构建列线图预测中国老年人T2DM的3年和5年的发病率。采用C指数、校准图、临床决策曲线(decision curve analysis, DCA)方法评估列线图在验证集中的准确性。最终发现年龄、空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)、体重指数(body mass index, BMI)、收缩压(systolic blood pressure, SBP)、甘油三酯(triglyceride, TG)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)和尿素氮(urea nitrogen, UN)是T2DM的独立危险因素,并将其纳入列线图。在训练集和验证集中,C指数分别为0.827 8(95%CI:0.812 5～0...     

乒乓球运动对2型糖尿病患者糖化血红蛋白影响的研究

随机选取50名2型糖尿病患者,分为运动组和对照组,观察乒乓球运动对其糖化血红蛋白的影响.运动组进行4个月的乒乓球运动.检测实验前后安静空腹状态下糖化血红蛋白以及常规血糖和血脂指标.乒乓球锻炼有助于2型糖尿病患者糖化血红蛋白、血糖和血脂指标的改善(分别P<0.05和P<0.01).乒乓球运动锻炼对2型糖尿病患者有较好的辅助治疗作用,是有效的康复手段.