重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的药效学研究

犬静脉给予重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)1×106IU/kg、5×105IU/kg、2.5×105IU/kg对冠脉血栓产生显著的溶栓效果,栓塞冠脉血管很快出现再通,高、中、低剂量组残存血栓较溶剂对照组分别减少了72.7%、55.6%、42.5%;心肌梗死范围明显缩小.血纤维蛋白原明显降解,凝血酶原时间、凝血酶时间及陶土激活部分凝血酶时间明显延长,但抗凝血酶活性无显著改变.伤口出血量增加,出血时间延长.以上指标与等剂量(5×105IU/kg)的德国BoehringerMannheimGmbH产品Retavase作用相似.离体家兔血小板凝集实验结果表明:重组人K2tPA对家兔血小板聚集功能具有明显的抑制作用.     

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆及工程菌的构建与鉴定

利用RT-PCR技术,从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因,将其接入TA克隆载体PCR2．1中,经DNA序列测定后,以该重组质粒DNA为模板,用PCR方法获得了人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)基因,将其转入pET29a,构建了重组表达质粒pET29a／K2tPA,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,构成工程菌．经IPTG诱导表达,在40kDa处有一明显表达条带,表达量为约占菌体总蛋白的20％．该菌种在贮存与复苏及传代过程中具有良好的质粒稳定性和表达稳定性．     

重组纤溶酶原激活剂及其突变体的表达研究

利用PCR技术 ,获得了人体组织型纤溶酶原激活剂tPAcDNA的缺失突变体———rPA ;在此基础上 ,运用定点突变技术 ,得到rPA的定点突变体———rPA(KHRR2 96～ 2 99AAAA) ,rPA(A473S)和二者的复合突变体rPA(KHRR2 96～2 99AAAA A473S) ;将rPA及其 3个突变体分别亚克隆至原核表达载体pET 2 8a( )中 ,获得表达载体pErA ,pErA(K) ,pErA(A)和pErA(KA) .酶切鉴定和序列分析结果均表明实现了实验设计的氨基酸突变 .表达载体转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导、菌体裂解及SDS PAGE电泳分析发现 ,只缺失而无突变的pErA和突变的pErA(A)都未表达目的蛋白 ,突变体pErA(K)与pErA(KA)则获高水平表达 ;蛋白产量分别占菌体总蛋白的 35 .97%与 37.71% ,分子量均为 39.6kD .Westernblotting显示 ,表达产物与抗tPA抗体呈特异性阳性反应 .该产物经初步纯化后进行复性与活性 (mFAPA)测定 ,结果表明其复性产物具有明显的体外纤溶活性 .以上结果为rPA突变体的进一步纯化、体内活性研究以及规模化制备提供了基础     

组织型纤溶酶原激活剂突变体基因转染细胞株的建立

以脂质体介导法将含有t-PA突变基因的真核表达载体pCSRA及pCSRK分别转染CHO-dhfr^-,经G418及DMEM双重选择,获得两者的稳定表达细胞株。结果表明,表达产物具有良好溶纤活性;Western印迹实验证明,产物具有特异抗原性;经多次传代,细胞株具有良好的稳定性。比较了无血清培养基CHO-S-SFMⅡ与常规培养基DMEM培养条件下pCSRK细胞株产物的表达量,前者约为后者的2倍,表明无血清培养基SFM有可能用于药用性蛋白的生产。实验为t-PA新型突变体的临床应用打下一定基础。     

用静息细胞培养法研究影响组织型纤溶酶原激活剂生物合成的因素

建立了基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306生物合成组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)的静息细胞培养系统。确定静息细胞培养基的成分为：葡萄糖1．0g／L，尿素1．0g／L，K2HPO41．0g／L；静息细胞培养的条件为：选择发酵30h的菌体，10％的接种量，pH5．4，150r／min，28℃静息培养12h。并在该静息细胞培养系统中，研究了糖类、有机酸、氨基酸和金属离子等因素对里氏木霉306生物合成组织型纤溶酶原激活剂的影响。     

人组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）在大肠杆菌中的表达、复性及分离纯化

人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ—ＰＡ）。ＤＮＡ重组在表达质粒ｐＤＲ７２０中，在Ｅ．ｃｏｌｉＣ６００中获得了表达，表达水平为２％．以醋酸钟显色ＰＡＧＥ凝胶回收ｔ—ＰＡ表达条带，进行复性处理．Ｒ性产物经Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，Ｌｙｓｉｎｅ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，纯化得到ＳＤＳ—ＰＡＧＥ银染一条带纯度，比活为为４，０００ｍｏｌ／ｓ·ｇ的人ｔ—ＰＡ．     

碳源及氮源Trichoderma reesei306对组织型纤溶酶原激活剂生物合成的影响

本文对不同种类的碳．氮源对Trichoderma reesei306组组织型纤溶酶原激活剂(t—PA)生物合成的影响进行了研究。结果表明：在所试的各种碳氮源中，碳源以玉米粉和纤维素，氮源以尿素和胰蛋白胨效果最好，通过正交试验确定了液体发酵培养基中碳氮源的最佳组成为：玉米粉20g／l、纤维素30g／l、尿素10g／l、胰蛋白胨2g／l，优化碳氮源后t—PA酶活提高了26％。     

重组人尿激酶原的工业化制备与性质研究

将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport亲和层析去热源 ,每 10 0L发酵液得重组人尿激酶原纯品 6g ,纯度达 95 %以上 ,比活大于 1.2× 10 4 IU /mg ,双链含量低于0 .5 % ,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准 .其分子量 (质谱测定 )、氨基酸组成、N、C 端氨基酸序列分析等均与理论值相符 .进行了等电点及肽图等性质研究     

尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)系统在子宫内膜癌中的研究进展

尿激酶型纤溶酶原激活系统是纤溶系统的重要组成部分，它通过水解细胞外间质，参与组织改造和细胞迁移，在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥作用；讨论了uPA系统的结构、作用机理及与子宫内膜癌的关系，旨在为子宫内膜癌的诊断和治疗提供新方法。     

尿激酶型纤溶酶原激活剂在小鼠皮肤创伤修复中的作用

观察uPA在小鼠皮肤创伤修复中的作用,以及外源性应用uPA对损伤表皮创伤修复的超微结构变化。在创伤部位外源性应用uPA后,利用光镜及扫描电镜等方法,比较观察了不同时间及浓度的uPA对损伤表皮组织修复,尤其是基底细胞迁移的影响,结果发现uPA浓度为100μg/mL及200μg/mL时,与对照组比较,基底细胞提前发生迁移,较对照组早1h。创伤部位外源性应用uPA,有利于表皮基底细胞的迁移,这种促进细胞迁移作用可能对于治疗皮肤创伤早期愈合有重要影响。     

重组人骨形成蛋白-4的大规模制备

含有能够高表达重组人骨形成蛋白成熟肽（recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP-4m）质粒的工程菌株,导人15LNBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,测定发酵菌液OD600值为30．8。离心收集菌体,PAGE电泳后光密度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的42％。悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的83．2％。预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体用8mol尿素缓冲液溶解,上SP-Sepharose FF阳离子柱．以0.35mol NaCl洗脱．获得纯度为96％的hBMP-4m。其收获量为1．34s／L发酵液;收得率为36.4％。结果表明：使用这套工艺流程大规模制备hBMP-4m,能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度。     

基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化

含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。     

重组人促红细胞生成素的基本特性研究

重组EPO细胞灌注法培养的收获液,用Q SepharoseXL,C4反相疏水和Superdex75层析柱纯化表达的EPO.经SDS PAGE、PAGE和HPLC分析纯度达98%以上,总回收率为17%.经SDS PAGE分析其表观分子量为32～40kD.用IEF方法测得pI为3.75～4.15.网织红细胞计数法测得体内比活大于1.5×105IU,用ELISA测得体外活性为1.5×106～1.6×106IU.纯化的EPO的氨基酸组成和其它一些性质也进行了研究.     

重组人SOD2／3杂合酶的制备及其生物活性初探

为获得重组SOD2／3杂合酶,以及观察SOD2／3能否转导入宫颈癌细胞,抑制肿瘤细胞的增殖,构建了原核表达载体pET—SOD2／3,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达获得N端带有6个组氨酸标签的sOD2／3杂合酶;用Ni柱金属螯合亲和层析纯化重组SOD2／3;利用肝素柱层析验证SOD2／3的肝素靶向性;将...     

重组人尿激酶原药效学研究

利用人血浆及其产生的血栓凝块 ,在试管中模拟纤溶酶原激活剂在体内引起血栓溶解的过程及麻醉开胸犬电刺激冠脉左旋支引起的冠脉血栓形成模型评价重组人尿激酶原的溶栓活性 ,并与尿激酶进行比较 .InVitro实验结果表明 :2 4 0IU /mL是 prouk血纤维蛋白专一的最大浓度 ,低浓度的重组prouk比天然 prouk具有更高的溶栓能力 ,这可能与其非糖基化结构有关 .当重组prouk浓度小于 1μg/mL时 ,它在血浆中几乎不降解任何纤维蛋白原 .犬静脉给予重组人尿激酶原 9× 10 4 、4 .5× 10 4 、2 .2 5× 10 4 IU·kg- 1 对冠脉血栓产生显著的溶栓效果 ,栓塞冠脉血管很快出现再通 ,残存血栓较溶剂对照分别减少了 6 9.2 %、5 7.0 %、4 3.1% ;心肌梗死范围明显缩小 ;与等剂量尿激酶溶栓作用相似 .血浆优球蛋白溶解时间明显缩短 ;溶栓不伴有明显的血浆纤维蛋白原降解 ,而尿激酶溶栓的同时 ,纤维蛋白原明显降低 .除高剂量组个别动物外 ,对伤口出血量增加出血时间无明显影响 .而等剂量的尿激酶组伤口出血量及出血时间明显延长     

重组人促红细胞生成素对K562/A02多药耐药和K562药物敏感细胞增殖的影响

用ＭＴＴ法测定了重组人促红细胞生成素（ｒｈｕ－ＥＰＯ）对Ｋ５６２／Ａ０２多药耐药细胞系细胞和Ｋ５６２药物敏感细胞增殖的影响。研究发现,Ｋ５６２／Ａ０２与浓度为００７８、０１５６Ｕ／ｍＬ的促红素分别孵育时,其增殖活力比无ｒｈｕ－ＥＰＯ因子组低（Ｐ＜００１）;而Ｋ５６２与上述同样浓度的ｒｈｕ－ＥＰＯ孵育条件下,其增殖活力与无因子组比较差异无显著性意义（Ｐ＞０２０）。以上结果表明,ｒｈｕ－ＥＰＯ可能有抑制Ｋ５６２／Ａ０２细胞增殖的作用,而对Ｋ５６２细胞增殖无影响,提示ｒｈｕ－ＥＰＯ可能对多药耐药白血病的治疗有一些效果     

重组人尿激酶原急性毒性和长期毒性的研究

（1）重组人尿激酶原（prouk)单剂量分别经静脉和腹腔注射给药均未侧出小鼠的LD50,因此改作其最大给药量。结果表明,prouk单剂量经静脉及腹腔注射给药小鼠的最大给药量不低于9,000万IU／kg。（2） prouk 36.0万IU／kg、67．5万IU/kg、135．0万IU／kg和270．0万IU／kg四个剂量组连续给食蟹猴静脉滴注14d,每组4只猴,雌雄各半。实验过程中未见动物死亡。prouk36．0万IU/kg剂量组的食蟹猴给药期及恢复期,精神状态良好,一般行为活动正常,体重、分泌物、食欲及摄食量、心电图、血常规、血液生化、体表观察、尿常规和粪便隐血试验等基本正常,无明显变化。给药第14天和恢复期的脏器系数与病理组织学检查表明,动物的脏器、组织均未见由药物引起的异常病理改变,在生理盐水组或赋形剂组之间比较均无明显差异。而prouk67．5万IU／kg、135．0万IU／kg、270．0万IU／kg剂量组的食蟹猴出现皮下出血、充血、紫癜、尿、粪便隐血反应阳性、贫血以及心率加快等症状。给药期及恢复期,血清中检测出少量prouk抗体。结果表明,prouk的无毒安全剂量不低于36．0万IU／kg。