10种杓兰属植物rDNA ITS序列的克隆与分析

以10种杓兰属植物为材料,利用PCR技术从叶片DNA克隆ITS序列.测序结果表明,10种杓兰属植物ITS的长度为522-572 bp,变异位点194个,其中信息位点99个,单核苷酸变异位点95个;5.8S序列的长度均为170 bp,但变异位点十分丰富,其中信息位点30个,单核苷酸变异位点20个,利用这些位点可将10种杓兰属植物完全分开.系统发育分析结果表明,所研究的植物可分为三组,绿花杓兰、西藏杓兰、黄花杓兰和紫点杓兰聚为一组,高山杓兰、大花杓兰、褐花杓兰和杓兰聚为一组,斑叶杓兰和离萼杓兰聚为一组.序列已上传至NCBI,登陆号为JN018070-JN018079.本研究克隆和分析了10种杓兰属植物的ITS序列,为遗传多样性和系统发育研究奠定了基础.     

象山港黄墩支港菲律宾蛤仔种群COI和ITS1基因序列特征及遗传多样性分析

为了解象山港黄墩支港菲律宾蛤仔种质资源的遗传多样性现状, 采用COI和ITS1分子标记对该种群进行了基因序列特征和遗传多样性分析. 结果表明 在该种群30个个体中扩增得到的COI基因序列长度均为709bp, ITS1序列长度范围在693~729bp(共有746个位点). COI基因序列的位点中有670个保守位点(占94.50%)、39个变异位点(占5.50%); ITS1序列的位点中有保守位点671个(占89.95%)、变异位点62个(占8.31%)和缺失/插入位点13个(占1.74%). COI基因序列的保守性高于ITS1序列. 在COI基因序列中碱基(A+T)的占比(65.84%)高于(C+G), 而ITS1序列中则是碱基(A+T)占比(37.59%)低于(C+G). COI和ITS1序列的遗传距离分析均显示群体内遗传分化不明显. 基于COI基因序列和ITS1序列构建的遗传进化树显示 各科贝类分别相聚, 象山港菲律宾蛤仔位于帘蛤科的分支中, 其COI序列与杂色蛤进化关系最近. 遗传进化树中各种贝类的聚类关系与传统分类学结果相一致, 可作为分类的参考. COI和ITS1序列的平均核苷酸差异数分别为5.497和6.549, 核苷酸多样性指数分别为0.00775和0.00973, 单倍型数目分别为21和28, 单倍型多样性分别为0.963和0.993, 根据COI和ITS1两个序列计算得到的菲律宾蛤仔象山港群体单倍型多样性均大于0.5, 核苷酸多样性指数均大于0.005, 表明该种群遗传多样性丰富, 并处于稳定状态. 本研究结果补充了菲律宾蛤仔遗传多样性方面的研究资料, 并可为象山港菲律宾蛤仔种质资源保护和遗传育种提供理论基础.     

瓯江流域唇NFDA1和花NFDA1线粒体COⅡ基因部分序列分析

采用PCR技术获得了唇NFDA1(Hemibarbus labeo)和花NFDA1(H. maculatus)线粒体DNA细胞色素氧化酶(COⅡ)基因部分序列,将所得的COⅡ基因序列与4种取自GenBank的NFDA1属鱼类同一基因序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、种群遗传结构和分子系统发生研究中的应用价值.测序结果表明,在实际分析的600 bp序列中,序列A T含量(56.9%～57.8%)高于G C含量,物种间共有变异位点116个,其中简约信息位点46个;唇NFDA1和花NFDA12个地理种群间变异位点均为11个,唇NFDA1种群间碱基替换均为转换,花NFDA1的转换/颠换为8/3.以COⅡ基因片段序列为标记,用似刺鳊鮈(Paracanthobrama guichenoti Bleeker)作外群,构建了NFDA1属鱼类的系统发生树,其拓扑结构显示2个地理种群浙江花NFDA1单倍体Ⅰ(H1)与江苏花NFDA1首先聚为一支,然后与浙江花NFDA1单倍体Ⅱ(H2)形成一个单系群.韩国唇NFDA1和日本NFDA1为姐妹群,然后与中国花NFDA1(浙江和江苏)相聚为一支.长吻NFDA1和朝鲜NFDA1单独聚为一支,表明2者的亲缘关系较近.结果同时表明,韩国唇NFDA1与江苏花NFDA1、日本NFDA1和浙江花NFDA1(H1)的遗传距离均为0.008 4,结合形态特征鉴定,推测韩国唇NFDA1和日本NFDA1是中国花NFDA1(浙江和江苏)的同物异名.     

甜槠种群遗传多样性的简单重复序列区间初步分析

应用简单重复序列区间（ISSR）分子标记方法对甜槠种群的遗传多样性和遗传分化进行了初步研究．从100个引物中筛选出12个用于正式扩增的ISSR引物,在9个种群179个个体中共检测到202个位点,其中198个是多态位点,多态位点百分率（P）为98．02％．各种群多态位点百分率在60．40％～70．30％,平均为65．29％．甜槠物种水平的Shannon信息指数（I）为0．5322、Nei指数（h）为0．3597．各种群J平均为0．3635、h平均为0．2468．AMOVA分子差异分析表明,65．96％的变异存在于种群内,34．04％的变异存在于种群间,种群间的基因分化系数（GST）为0．3138．甜槠种群间的基因流（Nm）为1．0933．9个种群的平均遗传距离为0．1849,遗传距离与地理距离呈显著正相关．利用UPGMA法对9个种群进行聚类,结果显示浙江省内的8个种群聚成一类,庐山种群单独成一类．     

瓯江流域唇[鱼骨]和花[鱼骨]线粒体COⅡ基因部分序列分析

采用PCR技术获得了唇[鱼骨]（Hemibarbus labeo）和花[鱼骨]（H．maculatus）线粒体DNA细胞色素氧化酶（COⅡ）基因部分序列,将所得的COⅡ基因序列与4种取自GenBank的[鱼骨]属鱼类同一基因序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、种群遗传结构和分子系统发生研究中的应用价值．测序结果表明,在实际分析的600bp序列中,序列A＋T含量（56．9％～57．8％）高于G＋C含量,物种间共有变异位点116个,其中简约信息位点46个;唇[鱼骨]和花[鱼骨]2个地理种群间变异位点均为11个,唇[鱼骨]种群间碱基替换均为转换,花[鱼骨]的转换/颠换为8／3．以COⅡ基因片段序列为标记,用似刺鳊鮈（Paracanthobrama guichenoti Bleeker）作外群,构建了[鱼骨]属鱼类的系统发生树,其拓扑结构显示2个地理种群浙江花[鱼骨]单倍体Ⅰ（H1）与江苏花[鱼骨]首先聚为一支,然后与浙江花[鱼骨]单倍体Ⅱ（H2）形成一个单系群．韩国唇[鱼骨]和日本[鱼骨]为姐妹群,然后与中国花[鱼骨]（浙江和江苏）相聚为一支．长吻[鱼骨]和朝鲜[鱼骨]单独聚为一支,表明2者的亲缘关系较近．结果同时表明,韩国唇[鱼骨]与江苏花[鱼骨]、日本[鱼骨]和浙江花[鱼骨]（H1）的遗传距离均为0．0084,结合形态特征鉴定,推测韩国唇[鱼骨]和日本[鱼骨]是中国花[鱼骨]（浙江和江苏）的同物异名．     

菊花EST-SSR标记的开发与应用

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库下载7 259条菊花相关表达序列标签(EST)序列,经去除冗余序列拼接后得到3 784条Uni-ESTs,总长度为2 088.6kb.用MISA软件查找其简单重复序列(SSR)位点,共获得407个SSR位点,分布于355条EST上,出现的频率为10.76%.在搜索到的EST-SSR中,三核苷酸重复类型占主导地位,所占比例为47.42%.共观察到76种重复基元,出现最多的重复基元是A/T和ACC/GGT,其次为ATC/ATG,AAC/GTT,AC/GT,AAT/ATT.根据搜索结果随机设计了24对菊花EST-SSR引物,对14个菊花品种进行PCR扩增,发现有12对引物有较清晰且稳定的扩增产物(其中10对引物的产物存在多态性),共检出37个位点(其中多态性位点32个),平均每对引物可扩增出3.2条多态性片段.遗传相似性分析显示,14个品种的遗传相似系数在0.61～0.84之间,平均相似系数为0.67.     

免疫相关EST-SSRs标记筛选及其在大菱鲆异源雌核发育子代遗传分析中的应用

本研究对大菱鲆EST数据库中12 434条序列进行微卫星搜索,共搜索出831条EST-SSR序列,其中l6条为明确标注免疫相关功能的基因序列.根据此l6条EST-SSR序列设计引物,经过PCR扩增检测和反应条件的优化,最终筛选出9对扩增效果理想的EST-SSR标记对大菱鲆减数分裂雌核发育二倍体子代进行遗传变异检测,结果表明:在Scoph-2-1、Scoph-7-1、Scoph-10-1微卫星位点上大菱鲆亲本和雌核发育二倍体子代均为纯合基因型,其余6个微卫星位点(Psetta-1-1、Psetta-1-2、Psetta-3-1、Psetta-3-2、Scoph-4-1、Scoph-6-1)在大菱鲆雌核发育二倍体仔鱼群体中的观测杂合度≥0.700,期望杂合度0.460,平均期望杂合度为0.503.大菱鲆减数分裂雌核发育二倍体还显示出较高的重组率,平均重组率为89%;综合上述结果推断,9个免疫相关EST-SSRs标记可有效地用于分析大菱鲆减数分裂雌核发育二倍体子代的遗传变异;6个位点的重组率计算结果能够为今后对大菱鲆的着丝粒进行精确定位提供依据.     

中国西藏与中东地区近缘野生大麦遗传多样性的SSR标记分析

应用简单重复序列（SSR）标记方法对90个近缘野生大麦样本进行了遗传多样性分析，其中包括45份中国西藏近缘野生大麦样本和45份中东地区近缘野生大麦样本．从大麦的7个连锁群中选取27对引物用于PCR扩增，结果有11对引物扩增出有效多态性片段．11对引物共检测到126个等位变异位点，每对引物检测到5～22个SSR等位变异位点，平均每对引物检测到11．45个等位变异位点．中国西藏近缘野生大麦比中东地区近缘野生大麦平均每对引物多检测出2个位点．SSR结果采用NTSYS软件进行相似性系数计算，POPGNEN32软件进行遗传多样性系数计算，算术平均的非加权成对分组法（UPGMA法）构建聚类树状图，结果表明中国西藏近缘野生大麦样本比中东地区近缘野生大麦样本具有更高的遗传多样性，这为大麦的东方起源学说提供了新的佐证．     

鲥鱼、太湖新银鱼和大银鱼18S rRNA基因的克隆与序列分析

本文利用多对引物,扩增并测定出鲥鱼、太湖新银鱼和大银鱼18S rRNA基因部分序列,其长度均为1206bp,其中太湖新银鱼与大银鱼基因序列完全相同.将3种经济鱼类与GenBank中10种脊椎动物及头索动物文昌鱼的18S rRNA基因同源序列进行比对分析,计算出序列碱基组成、序列间差异百分比和转换/颠换数值.基于18S rRNA基因序列,利用NJ法、ML法和BI法3种聚类方法,以文昌鱼为外群,构建13种脊椎动物的分子系统树,3种方法获得拓扑学结构一致的系统树.系统树包括3大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的2个物种,另一支为5种硬骨鱼类.结果表明:鸟类与哺乳类亲缘关系较近,而胡瓜鱼目与鲑形目亲缘关系近于鲱形目.此外,本文还讨论了脊椎动物18S rRNA基因的序列特征.     

鄱阳湖区泥鳅的微卫星DNA多态性分析

应用SSR标记技术对鄱阳湖地区的3种不同斑纹泥鳅的遗传差异进行分析.利用6对特异性引物,在3种斑纹泥鳅中共获得67个微卫星位点,其中在大花斑泥鳅中多态性位点为45个,多态性比例为67.16%,小花斑泥鳅的多态性位点为39个,多态性比例为58.21%,无花斑泥鳅多态性位点为15,多态性比例为22.39%.大、小、无3种斑纹泥鳅的平均期望杂合度分别为0.155 4、0.179 9、0.085 7;平均多态信息含量分别0.273 7、0.362 6、0.198 9.分析显示3种花斑泥鳅间的遗传多样性很低,其中无花斑泥鳅尤甚.从Nei的遗传距离得到的系统聚类树状图显示小花斑泥鳅和无小花斑泥鳅先聚在一起,然后再和大花斑泥鳅聚在一起,结果显示小花斑泥鳅和无花斑泥鳅的亲缘关系更近.分析结果对我们正在开展的泥鳅良种选育具有重要的参考价值.     

猪瘟病毒RT-PCR产物的T载体克隆、测序及同源比较

利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶的无模板延伸活性制备了可直接克隆ＰＣＲ产物的Ｔ载体，并成功地对猪瘟病毒ＨＣＬＶ株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行了克隆．ＤＮＡ序列测定和同源性分析表明该ＲＴ－ＰＣＲ产物是猪瘟病毒特异的，与已知序列的猪瘟病毒毒株的序列同源性均高达９６．７％～９８．７％．ＨＣＬＶ株与Ｃ株具有相同的起源，但序列比较发现它们既有共同的点突变，也有序列上的差异，表明这两株病毒在各自独立的传代过程中已发生了各不相同的遗传性变异，值得进一步比较研究．     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

新城疫病毒HB 92株M基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)无毒耐热株(HB92株)M基因，将其克隆于pGEM-T载体，并进行了序列测定和分析．结果显示，测定的M基因长1223个核苷酸。包含一个1095个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸．与已报道的10株NDVM基因比较，核苷酸同源性为88．4％～95．8％，氨基酸同源性为89．8％～95．3％。HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高(达95．8％)．NDVM蛋白分子中有9对碱性氨基酸。在多肽的第117～120位有一个含4个氨基酸CKKS的特征性结构．这些结果为揭示NDV HB92株的分子生物学背景，了解NDV的分子进化和遗传变异机理，进而开发利用HB92株奠定了基础，也为将NDV另列为副粘病毒亚科的一个新属提供了理论支持．     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

凡纳滨对虾兰尼定受体基因亚克隆文库的构建及部分序列的测定

将一个含有凡纳滨对虾兰尼定受体基因的fosmid克隆用DNA剪切仪进行片段化处理,回收3～5kb之间的DNA片段连接到pUC118HincⅡ/BAP载体上,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆文库.经鉴定,该文库滴度为5.0×104 cfu.mL-1,重组率达到90%,插入片段大小在3～5kb范围内.随机挑取100个阳性克隆进行两端测序,通过拼接得到一条兰尼定受体基因部分片段,该片段长2 550bp.通过比对分析,发现该基因片段推导的氨基酸序列与果蝇兰尼定受体基因有较高的相似性.     

钝顶螺旋藻Fe-SOD基因的克隆及序列分析

参照GenBank中Fe-SOD基因序列,根据SOD的保守区域设计引物,以钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)基因组DNA为模板,PCR扩增获得大小为528 bp的片段.序列分析表明,其与集胞藻(Synechocystis sp.PCC 6803)、念珠藻(Nostoc commune DRH1)等物种的Fe-SOD基因的同源性分别为75%、71%,且由该序列推导的氨基酸序列与集胞藻、念珠藻等种属的Fe-SOD相比,同源性为68%、67%.表明该片段为钝顶螺旋藻Fe-SOD基因的部分序列.     

外显子拼接法合成真菌灵芝漆酶基因cDNA

为真菌漆酶基因cDNA的克隆提供了一种简便快速的新方法．从含有内含子的灵芝漆酶基因出发，采用外显子拼接PCR方法，合成了灵芝漆酶的cDNA．设计了10对引物分别经PCR扩增该基因的10个外显子，引物设计使前一个外显子的下游引物与下一个外显子的上游引物都有一段同源匹配序列，然后通过两两片段混合作为模板PCR扩增得到两两拼接的外显子片段，再将得到的5个片段前两个混合，后3个混合分别作为模板扩增获得拼接好的外显子1～4大片段和外显子5～10大片段，最后将这两个大片段混合作为模板扩增得到拼接好的全长cDNA序列．与常规方法相比，该方法既避免了RNA的操作，又不用摸索酶表达的条件，可以和基因组步行技术结合快速获得真菌漆酶基因的cDNA．     

H9N2亚型禽流感病毒细胞适应株细胞致病性和HA、NA基因序列分析

对分离自中国南方的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ/99(H9N2)进行了MDCK细胞的连续传代和NA基因序列的初步分析.研究发现,病毒接种细胞36 h左右出现细胞病变(CPE),细胞肿胀变圆,聚集,脱落.流感病毒经MDCK细胞连续传代19代后,HA效价与亲代病毒相当.将传代获得的第19代病毒进行基因克隆,与亲代病毒进行序列比较,发现经传代后其HA1羧基端的分子特征是:R-S-S-R,仍属于非低致病力毒株.     

一株鸭细小病毒的分离鉴定与ns基因序列分析

采用余姚某鸭场濒死鸭肝组织悬液，接种鸭胚尿囊腔增殖病毒，蔗糖梯度离心法纯化病毒，电镜观察见直径约20nm的球形病毒粒子，免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒（duck parvovirus，DPV）抗血清有明显沉淀线；SDS-PAGE电泳可见3条结构蛋白带，与DPV毒株一敛；参照GenBank DPVns基因序列979～1566bp设计引物，PCR扩增反应获得其目的片段．克隆到载体pMD18-T后测序，该序列与GenBank中的番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）以及巴比里鸭细小病毒（Barbarie duck parvovirus，BDPV）的ns基因序列同源性为98％．病鸭肝组织匀浆液雏鸭感染试验显示雏鸭发病症状及剖解病理变化明显，死亡率为75％．利用血清学实验与鸭肝炎Ⅰ型、禽流感和新城疫病毒感染举别．由此确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV，命名为04NY株．