半滑舌鳎两种Aquaporinl同源基因的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AQP1o和AQP1基因的全长cDNA序列,并对其序列和表达模式进行了分析.结果表明,AQP1o cDNA全长为993 bp,包括120 bp的5'非翻译区,789 bp的开放阅读框,84bp的3'非翻译区,编码262个氨基酸的蛋白质,分子质量为28.3×103.AQP1的cDNA全长为1 335 bp,包括63bp的5'非翻译区,786 bp的开发阅读框,486 bp的3'非翻译区,编码261个氨基酸的蛋白质,分子质量为27.4×103.聚类分析表明半滑舌鳎AQP1o蛋白与金头鲷和塞内加尔鳎等海洋鱼类在卵巢中特异表达的AQP1o聚为一类,而AQP1与非卵巢特异表达的AQP1聚为一类,表明该两类基因为不同类型的AQP1同源基因.RT-PCR分析表明两个基因具有不同的表达模式,AQP1o主要在卵巢中表达,提示其在卵巢中具有特定的生理功能、而AQP1则在雌雄鱼的多种组织中表达.     

虹鳟腺苷酸转移酶基因2(ant2)cDNA克隆与蛋白结构分析

腺苷酸转移酶(ANT)是位于线粒体内膜上参与能量分子传导的转运蛋白,在细胞凋亡调控网络中发挥重要作用.以虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)为研究材料,使用RT-PCR和RACE法分离和克隆了虹鳟鱼ant2基因cDNA的全长序列(GenBank登录号:FJ591153).该序列全长1276 bp,其中5'端非翻译区长66 bp,3'端非翻译区长316 bp,开放性阅读框长894 bp,编码297个氨基酸.该蛋白具有3个保守的线粒体穿膜功能结构域和3个转膜区.通过与其他脊椎动物腺苷酸转移酶蛋白序列的比较,发现该基因具有高度保守性,氨基酸序列的同源性均在90%左右.同源模建显示其与牛的线粒体ADP/ATP载体,chain A蛋白有相同的孔洞(cavity)结构.     

半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.     

北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

褶纹冠蚌硫氧还蛋白基因克隆及空间结构分析

运用RACE-PCR方法从褶纹冠蚌血细胞中克隆出硫氧还蛋白(Trx)的cDNA。结果表明褶纹冠蚌TrxcDNA序列全长为1 169bp,其中5′非编码区(UTR)长11bp,3′非编码区长840bp,含有PolyA尾和典型的腺苷酸信号序列AATAAA,开放阅读框长度为318bp,编码105个氨基酸。预测蛋白质分子量为11.6kDa,等电点为5.38,未发现有信号肽。氨基酸序列中含有1个Thioredoxin结构域(T3-K104),区域内包含一个保守的CGPC活化位点。序列同源性比较结果显示褶纹冠蚌Trx与太平洋牡蛎和紫贻贝的氨基酸序列一致性分别为56%、52%。预测的Trx空间结构由5个β折叠和4个α-螺旋组成,α-螺旋包围β折叠形成紧密的球形,这一结构与人的Trx空间结构相似。     

普通鲤与建鲤MSTN基因比较分析

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子。采用RACE和基因组步移分别克隆获得了普通鲤MSTN cDNA基因全序列和MSTN基因组序列;普通鲤MSTN cDNA全长2 188bp,共编码375个氨基酸,提交GenBank获得序列登录号GQ214769.1,普通鲤MSTN基因组序列长为3 690bp,包含3个外显子和2个内含子,获得序列登录号GQ214770.1。聚类分析表明,克隆的鲤MSTN为MSTN1a;将普通鲤MSTN与人工育成品种建鲤MSTNs多层次比较,普通鲤MSTN同建鲤MSTN1a在核苷酸水平上的碱基差异位点分别为G(320)A,G(723)A,G(730)A,G(2121)A,A(2794)G,在蛋白水平仅V(78)I替换,暗示了MSTN1a在育种工作中承受的选择压力较大,研究结果为突变位点与鲤生长性能有可能的关联分析奠定基础。     

温度对尼氏真绥螨捕食桔全爪螨功能反应的影响

在实验室5个恒定温度(16℃、20℃、24℃、28℃和32℃)条件下,研究了尼氏真绥螨Euseius nicholsi雌成螨对桔全爪螨不同螨态的捕食功能反应。结果表明,在各温度处理设置范围内,尼氏真绥螨雌成螨对桔全爪螨各螨态的捕食功能反应均拟合HollingⅡ功能反应模型;在相同温度下其捕食量随着猎物密度的增加而增加;温度对尼氏真绥螨雌成螨的功能反应有明显的影响。在16℃~32℃范围内,尼氏真绥螨对卵的瞬间攻击率最低,最高的是若螨;对幼螨的处理时间最短,最长的是卵;对幼螨的理论捕食量最大。在实验温度范围内,尼氏真绥螨雌成螨对桔全爪螨各螨态的控制能力(a/Th值)随温度升高而增大,在28℃时达到峰值。另外,尼氏真绥螨对各螨态的桔全爪螨的取食具有选择性,桔全爪螨的幼若螨是尼氏真绥螨的嗜好虫态。     

莲铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆和序列分析

用RT-PCR方法,从中国莲(Nelumbo nucifera)幼叶cDNA中成功扩增出铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)全长序列,并进行测序分析.该cDNA序列全长461 bp,包括起始密码子和终止密码子.其中编码区段为456 bp,共编码152个氨基酸,其编码蛋白的相对分子质量为1.552×104,等电点为4.515.与GenBank中其他物种的CuZnSOD进行同源性比较,发现其核苷酸序列相似性高达80%~86%,氨基酸序列相似性达89%~94%.所有已知的CuZnSOD的关键活性位点在该蛋白中均保守存在.将其与一些典型的单子叶和双子叶植物的该蛋白进行进化树分析,为富有争议的莲的系统学地位的确定,在分子生物学上为莲的系统学地位的确定提供了一个依据.该基因已在GenBank登记,序列号为DQ227345.     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.     

RACE法克隆黑曲霉NCU-317中α-L-鼠李糖苷酶基因与生物信息学分析

实验室前期筛选得到一株能够产α-L-鼠李糖苷酶的黑曲霉NCU-317,但由于其完整产酶序列未知,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和改良cDNA末端快速扩增(RACE)法,以克隆得到的黑曲霉NCU-317 cDNA为模板,成功克隆得到其α-L-鼠李糖苷酶基因全长。克隆得到α-L-鼠李糖苷酶基因共3 018 bp,其中含有2 748 bp的完整开放阅读框,5’非编码区长为216 bp,3’非编码区长为54 bp。经过对序列的生物信息学分析显示:编码蛋白由915个氨基酸组成,预测理论分子量为103.94 kD,等电点为5.59;蛋白质二级结构以无规则卷曲为主;将氨基酸序列输入UniProt比对后发现,黑曲霉NCU-317的产酶序列与黑曲霉A0A254UAG7同源性最高,达到了99.6%。