根癌农杆菌的高效电激转化

利用电激法将双元载体质粒ＰＢＩ１２１导入根癌农杆菌ＡＧＬ－１并获得较高转化效率．探讨了不同电激条件对转化效率的影响，并检测了ＣａＭＶ３５Ｓ启动子启动ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中的表达．结果表明：根癌农杆菌电激转化的最适电激条件为１１ｋＶ／ｃｍ，２１．５μＦ，电场强度是影响转化效率的关键因素．当质粒ＤＮＡ浓度从０．２ｍｇ／Ｌ增加至０．６ｍｇ／Ｌ时，转化效率呈线性增加．细菌密度对转化效率也有一定影响．最高转化效率为每μｇ质粒ＤＮＡ１．７×１０５转化子．组织化学反应证实ＣａＭＶ３５Ｓ能启动ＧＵＳ基因在根癌农杆菌中表达．     

盐胁迫下杜氏盐藻(Dunaliella salina)cDNA文库的构建与新表达序列标签(EST)的获取、分析

在成功养殖杜氏盐藻(Dunaliella salina)的基础上,采用Takara cDNA文库构建试剂盒,构建盐胁迫下(1.5 mol/L NaCl)杜氏盐藻的cDNA文库.经鉴定,原始文库的滴度达1.2×106 cfu/mL,重组率高达95%,且多数插入片段均在500 bp以上.对表达序列标签(expressed sequence tag,EST)分析发现,杜氏盐藻基因组中包含大量未鉴定的新基因.随机挑取60个单克隆进行序列测定,将所测序列经Blast比对等生物信息学方法分析后,发现其中三分之一,即20个未见报道的代表新基因的表达序列标签,值得进一步发掘.这些新表达序列标签(基因)的发现,为进一步筛选和克隆杜氏盐藻耐盐性基因提供了筛选平台.     

蝎神经毒素AaIT的表达及功能分析

在不改变氨基酸编码序列的情况下，根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计并人工合成了适合于大肠杆菌表达的蝎神经毒素AaIT基因．将该基因插入到大肠杆菌表达载体PET32a＋中，得到重组质粒PET32a-AaIT，将该质粒转入带有trxB／gor双突变的大肠杆菌Origami（DE3），重组菌株经IPTG诱导后，获得町溶性表达产物，但该表达产物没有生物学活性．把此基因插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC6αA构建重组质粒pPIC6αA-AalT，转化毕赤酵母（X-33），经甲醇诱导后，获得高水平的分泌表达（20mg／L）．表达产物喂食银纹夜蛾及甜菜夜蛾没有表现出生物活性，经注射有活性．     

人卵透明带3基因片断hZ3.3的克隆及其在毕赤酵母中的表达

为了探讨透明带与精子的作用机制,人卵透明带3(human Zona Pellucida 3,hZP3)第19l位氨基酸到319位氨基酸之间的cDNA序列通过PCR方法扩增后,克隆到表达载体pPICZαA上,构建成重组质粒pPICZαA-hZ3．3。该质粒经SacⅠ线性化后电打孔转入Pichia pastoris酵母X-33中,用YPDS Zeocin^ 筛选高拷贝转化子,并用PCR分析鉴定目的基因片断与酵母基因组的整合,阳性转化子用0．5％甲醇诱导,表达目的蛋白。经SDS-PAGE凝胶电泳和Western-blot鉴定分析,结果表明目的基因成功表达,表达产物大小约为37kD。     

人白细胞介素10(hIL10)在毕赤酵母中的表达

利用PCR技术从质粒pcDNA3．1／GS扩增得到hIL10基因．将其插入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K／IL10，转化毕赤酵母GS115，筛选出整合了多拷贝白细胞介素10基因的菌株，经摇瓶培养，0．5％甲醇诱导表达、SDS-PAGE分析显示，表达产物以可溶性分子形式存在于上清中，诱导4d的表达量达到高峰．Western印迹表明．表达产物具有良好的抗原性和特异性．     

重组真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ的构建及其在胃癌细胞MGC80—3中的表达

目的构建新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因的真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ（pEGFP—cec），检测其在肿瘤细胞中的表达情况，探讨抗菌肽对肿瘤细胞的作用机制和抗菌肽抑瘤作用效果．方法应用基因重组技术，将新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因克隆到真核表达载体pEGFP—C1，通过酶切和测序的方法鉴定重组质粒pEGFP—cec的正确性．将pEGFP—cec经脂质体法转染到胃癌细胞MGc80—3，48h后观察EGFP瞬时表达情况；72h后，应用RT—PCR，检测抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；96h后，消化细胞，经台盼蓝染色，检测重组质粒pEGFP—cec表达产物对肿瘤细胞的影响．结果细胞转染48h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，发出绿色荧光；转染72h后，RT—PCR检测到胞内有抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；表达产物能够抑制肿瘤细胞的生长．结论成功构建了真核表达载体pEGFP—cec，并在肿瘤细胞中可见抗菌肽cecropin—XJ和EGFP基因的有效表达以及表达产物具有显著的抗肿瘤活性．为深入开展抗菌肽抑制肿瘤的研究奠定基础．     

蛋白A-藻蓝蛋白β亚基融合蛋白的性质及应用

PCR扩增金黄色葡萄球菌蛋白A基因spa,通过酶切位点的转换构建重组质粒pET-spa,进一步成功构建能表达融合蛋白SPA-CpcB的质粒pET-spa-cpcB.将重组质粒pET-spa-cpcB与在大肠杆菌内生成藻胆色素必需的质粒,以及藻胆蛋白裂合酶质粒,共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,生物合成融合色素蛋白.蛋白质电泳以及锌染色结果表明,体内重组分别获得了融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB.吸收光谱与荧光光谱结果表明,融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB具有与CpcB-PCB或CpcB-PEB相同的光谱特征.将SPA-CpcB-PEB与生物素标记的兔抗体进行荧光免疫反应,通过多功能微孔板荧光检测仪检测,结果表明融合色素蛋白SPA-CpcB-PEB具有SPA能与多种哺乳动物血清中的IgG的Fc段结合的特点.利用SPA-CpcB-PEB来检测包被于聚苯乙烯微量反应板的基因编码为all5292的蛋白,证实了该融合色素蛋白可用于免疫检测.     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

集胞藻PCC6803脂肪酸脱饱和酶基因desD在转基因水稻中的表达

为了提高水稻的耐冷性，从集胞藻PCC6803中克隆酰基脂肪酸脱饱和酶基因desD与植物表达载体pCAMBIA1301连接，构建了重组质粒pCdesD。采用农杆菌介导的水稻愈伤组织转化系统将desD基因成功地导入粳稻中花11号和朝鲜的平壤21号中，获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析，证明外源基因已导入并整合到水稻的基因组中；分子检测外源基因单拷贝整合的转化体在T1代呈现3：1的分离。Northern杂交结果表明该基因在mRNA水平上获得表达。低温胁迫处理后，对转基因水稻进行脂肪酸成分和光合生理分析，结果表明转基因水稻提高了不饱和脂肪酸含量，光合生理也得到了改善，水稻的耐寒能力明显增强。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶的表达及抗体制备

以禽流感病毒A／chicken／Hubei／489／2004（H5N1）NA基因全长eDNA克隆pMD-NA为模板，PCR扩增第406位至第1353位基因片段。克隆到pET-28a表达载体，构建重组质粒pET-28／ANA，转化大肠杆菌，用异丙基口硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE和Western blot分析证实，截短的NA重组蛋白获得高效表达。采用SDS-PAGE纯化重组蛋白，免疫家兔，制备特异性神经氨酸酶（NA）抗体。ELISA及间接免疫荧光检测结果显示，该抗体效价在1：1×10^5以上，能与在大肠杆菌和Vero细胞中表达的NA蛋白产生特异性反应。纯化的NA重组蛋白可用作建立禽流感检测方法的诊断抗原，所制备NA抗体可用于检测禽流感基因工程疫苗中的NA抗原组分。     

人新型肿瘤坏死因子在E.coli中的 高效表达、纯化及诱导凋亡活性

采用PCR技术获得了新型的人肿瘤坏死因子基因,在153位氨基酸处引入突变,使Gly突变为Leu.将突变体hTNF基因克隆到表达载体pQE30中,SDS-PAGE结果显示经IPTG诱导后,hTNF基因获得大量表达.通过Ni金属鳌合层析柱亲和层析获得到纯化的hTNF融合蛋白,Westernblot结果表明hTNF蛋白可与抗TNF的抗血清发生特异性反应.荧光染色实验检测了hTNF蛋白诱导细胞发生凋亡的活性.     

粘虫核型多角体病毒p35基因抑制细胞凋亡的功能研究

利用去血清方法建立Ls细胞凋亡的实验体系，证明LsNPV p35基因在Ls细胞中瞬时表达可以抑制Ls细胞由于无血清造成的凋亡，构建了在哺乳动物中高效表达LsNPV p35基因的载体pRc/RSV-L p35,并导入Vero细胞瞬时表达，发现LsNPV p35基因产物也可以抑制Vero细胞由于病毒感造成的凋亡，用含LsNPVp35的质粒与vAcAnb(AcNPV p35基因缺失病毒）DNA共转浸Sf-9细胞，可以使vAcAnhDNA在St-9细胞中形成多角体，并且传代后多角体不扩增，表明LsNPV p35基因与AcNPVp35基因具有功能互补性。     

HCVNS2基因表达载体的构建及在E.coli中表达

PCR人含有丙肝病毒全长非结构蛋白的载体pBlueBac25中扩增出全长的NS2基因DNA片段,分别克隆到表达载体pQE30和转座载体pFasBacHTb的多隆位点（MCS）,PFastNS2通过转座插入穿梭载体Bacmid的表达盒;pQENS2转化JM109菌株,诱导表达出N端含有6个His的全长His的全长NS2蛋白,用Ni-NTA-agarose柱层纯化,获得提纯的全长NS2蛋白。     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX的克隆与表达分析

根据NCBI基因数据库提供的抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase,APX)基因序列设计简并引物,以青花菜(Brassica oleracea var.italica)叶片cDNA和DNA为材料进行PCR扩增,基因定名为BoAPX(Gen-Bank登录号:HQ871864).BoAPX的基因组全长为1 394bp,具7个内含子,编码区全长为753bp,编码250个氨基酸残基.序列分析结果表明,BoAPX的N端中没有信号肽序列,为胞质型APX,BoAPX与已知APX具有较高的同源性.RT-PCR结果表明,BoAPX的表达受霜霉菌(Hyaloperonospora parasitica)诱导,在96h时达最大值,说明BoAPX与霜霉菌抗性相关.以pBI121为植物表达载体,BoAPX为目的基因,成功构建了重组表达载体pBI121-BoAPX.     

产黑色素B.thuringiensis重组菌株的构建及其培养条件的优化

将嗜麦芽假单胞菌中产生黑色素的基因(mel gene)克隆到穿梭载体pHT3101中，并将它处于表达系统cry3A的控制下，构建得到重组质粒pHTAM．将此重组质粒用电脉冲的方法转入苏云金芽胞杆菌受体菌株BMB171中，得到重组菌株RSA．研究结果表明，处于cry3A控制下nel基因在BMBl71菌株中得到了成功的表达．本研究进一步采用红外光谱扫描法检测RSA所产黑色素的性质，并通过改变培养条件来提高黑色素的产量．     

纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备

纳豆激酶是一种源于日本传统食品纳豆且具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶．本研究将编码信号肽、前导肽和成熟肽在内的纳豆激酶基因克隆到原核表达载体pET28a^＋中,获得重组表达质粒pETNK．将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达．SDS-PAGE结果显示纳豆激酶在大肠杆菌中成功表达,表达的纳豆激酶融合蛋白分子量大约为31kD．亲和层析法纯化表达产物,并以此纯化产物作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗纳豆激酶血清,用ELISA和Western blotting对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定．纤维蛋白平板实验显示,表达的纳豆激酶融合蛋白具有较好的溶纤活性．     

密码子优化的人溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗菌活性分析

人溶菌酶（human lysozyme,hLYZ）是一种天然活性蛋白质,具有抗菌性,目前主要应用于食品添加剂、动物饲料、药物治疗领域。根据毕赤酵母表达偏爱密码子特点,通过优化hlyz基因密码子,人工合成目的基因,构建了分泌表达载体pPIC9K-hlyz。通过电击转化法将pPIC9K-hly质粒重组至毕赤酵母GS115染色体中,经筛选得到重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-hlyz。在28 ℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1、1%甲醇诱导下表达120 h,发酵液上清酶活达到最高,为（2 414.9±108.1）U·mL^-1,蛋白浓度为166.7 μg·mL^-1。发酵液上清经过Sephadex G50纯化,获得较纯的hLYZ,经SDS-PAGE分析,在近14.7 kDa处显示单一条带。抗菌实验结果表明,重组hLYZ对革兰氏阳性菌的抗菌效果大于革兰氏阴性菌;重组hLYZ的抗菌效果是hLYZ标准品的10~20倍。     

陆地棉体细胞胚胎的发生和遗传转化条件初探

以陆地棉（冀棉20）下胚轴为外植体，在含KT0．3mg／L和2，4－D0．08mg／L的MS培养基上，诱导产生了胚性愈伤组织，继代培养不需要添加激素，胚性愈伤组织即分化为胚状体，并萌发出小芽，胚状体萌发过程与合子胚相似，但出现了一些畸形胚，解剖学方法观察发现，这些畸形胚的维管束系统不明显或形态异常，以农杆菌介导法对冀棉20胚状体及胚性愈伤组织进行了雪花莲凝集素（GNA）基因的遗传转化条件探索，并以GUS基域瞬间进行检测加以证实，得出农杆菌的浓度为O．D600＝0．8时，浸染时间为5min，共培养时间为3d，筛选培养基中卡那霉素浓度为75mg／L，对冀棉20胚状体及胚性愈伤组织转化是较为适合的。     

微量热技术检测古生菌启动子DNA片段的启动功能

用微量热法研究了大肠杆菌HB101及其重组菌株的代谢特征．将不同大小的来源于嗜盐古生菌染色体DNA的启动子片段插入启动子探针载体中的氯霉素抗性基因前，获得重组菌株．结果表明重组菌株的半抑制浓度与DNA片段的启动功能大小是一致的，并且质粒的复制几乎不影响菌株的生长及代谢．培养基中加入氯霉素后，启动子启动氯霉素抗性基因表达，生长速率(k)降低，最大峰的出现时间(tp)延长，最大峰值(pm)也随之降低．在一定范围内，抗生素浓度与tp、pm呈线性关系．本研究结果直接证明了来自嗜盐古生菌的RM07、RM08和RM13片段在大肠杆菌中是有启动功能的，而且还表明基因表达量的高低与释放的代谢热变化相一致．因此微量热技术有可能为检测古生菌基因表达及其调控以及揭示古生菌这一特殊生命体的遗传和代谢特征提供一种新的灵敏的方法．