基于聚合酶反应和发夹型核酸适体的蛋白质荧光检测新方法

设计合成了一种发夹型核酸适体(Aptamer), 结合聚合酶反应建立了蛋白质荧光分析新方法. 该核酸适体同时作为蛋白质配体和聚合反应模板, 与靶蛋白特异结合后, 其构象发生了变化, 启动聚合反应, 从而在未直接标记核酸适体的情况下, 通过监测聚合反应进程来检测蛋白质的浓度. 采用该方法检测凝血酶的线性范围为0.5~8 nmol/L, 检测下限为0.5 nmol/L, 为蛋白质检测提供了一种简便快速的非直接标记的荧光分析方法, 有望在蛋白质组学的研究中得到广泛的应用.     

基于阳离子荧光共轭聚合物和核酸适体探针的蛋白质检测新方法

以核酸适体为识别分子, 阳离子荧光共轭聚合物为报告分子, 建立了一种蛋白质检测新方法. 修饰有荧光熄灭基团的核酸适体探针通过静电作用与阳离子荧光共轭聚合物结合, 导致后者荧光熄灭. 当加入靶蛋白后, 核酸适体探针与其特异性结合, 荧光熄灭基团与阳离子荧光共轭聚合物远离, 聚合物荧光信号得以恢复. 实验结果表明, 荧光恢复程度与靶蛋白的浓度正相关. 采用该方法检测凝血酶的线性范围为17～40 nmol/L.     

基于荧光探针噻唑橙与核酸适体构象变化的钾离子检测

建立了一种基于核酸适体(Aptamer)构象效应和荧光探针噻唑橙(TO)为荧光分子开关进行钾离子检测的光学方法.室温下钾离子可与Aptamer结合形成G-四面体结构,使双链解链变为四面体结构和单链,从而导致TO荧光强度降低.考察了TO浓度、反应温度及反应时间的影响.在最佳实验条件下,钾离子浓度在1.0×10-6 ～2....     

基于核酸适体构象变化的荧光钾离子检测

噻唑橙(Thiazole orange,TO)在游离状态下几乎没有荧光,但当其与富G的DNA结合后,会产生很强的荧光增强效应。据此,利用TO识别有无钾离子存在时富G序列的构象变化,建立了一种基于核酸适体(Aptamer)构象效应进行钾离子检测的无标记荧光检测方法。在优化实验条件下,钾离子浓度在(1～60)×10-6mol/L和(4～9)×10-4mol/L范围内与荧光强度呈良好的线性关系,检出限(S/N=3)为2.2×10-7mol/L。对Li+、Na+、Ca2+、Mg2+、NH4+5种离子进行对照试验的结果表明,该方法不仅具有较好的灵敏度还具有较好的选择性,且无需对DNA进行标记,成本低,分析速度快。     

核酸适体识别荧光法检测汞离子

通过对已知的Ni2+适体的改造,发现了对Hg2+有较强结合活性的核酸适体N1,基于N1的二级结构进行改造,获得了具有较高活性的核酸适体N5,并建立了荧光检测方法。以荧光基团FAM标记核酸适体,在94℃变性5 min,室温(25℃)下复性30 min后,适配体与标记有荧光猝灭基团DABCYL的一段互补序列Q2结合(适体与Q2的浓度比为1∶3),加入系列浓度的Hg2+与互补序列竞争结合核酸适体,以荧光信号的变化定量分析Hg2+浓度。结果表明,N1与Hg2+结合呈线性,线性范围为1.25～20 mg/L;检出限为0.62 mg/L;以N1结构为基础改造合成的序列和结构均不同的适体N4,N5,N6,N7对Hg2+的识别结合活性均不同,其中适体N5与Hg2+结合活性最为灵敏,特异性高,线性范围为0.156～2.50 mg/L;检出限为78μg/L。     

核酸适体生物传感器*

构建高速度、高特异性、高灵敏的蛋白质检测技术是目前蛋白质组学研究所面临的紧迫任务。传统蛋白质的检测主要利用抗体-抗原的特异相互作用。利用寡核苷酸间的严格的识别和亲和力而设计的人工合成寡核苷酸-适体（aptamer）的出现,使抗体抗原反应发生新的革命性变化。核酸适体对蛋白质的结合力和特异性可与抗原抗体间的作用力相媲美,且与抗体相比有许多优越性。因此利用核酸适体构建蛋白质的检测方法己引起许多科学工作者的关注。本文综述了核酸适体的发现(包括SELEX技术的原理),特点, 核酸适体生物传感器的原理、分类和应用,并对核酸适体生物传感器的发展进行了展望。     

单分子荧光成像研究凝血酶核酸适体的折叠

通过对固定在表面的TMR标记凝血酶核酸适体进行单分子荧光成像, 在单分子水平上研究了凝血酶核酸适体的折叠. 在有K+存在的条件下, 核酸适体分子与K+结合后发生折叠, 形成G四分体结构, 使得TMR靠近富含鸟嘌呤的G四分体, 并与鸟嘌呤发生电子转移, 从而导致TMR荧光强度降低. 根据TMR的单分子荧光强度观察到不同K+浓度下核酸适体在折叠和无规卷曲两种状态下的分布. 结果表明, 可利用电子转移引起的荧光强度变化在单分子水平上研究核酸适体构象变化, 这一新方法的建立是对常用的单分子荧光共振能量转移(FRET)法的重要补充.     

核酸适体与互补核酸和目标蛋白之间竞争结合的热力学特性研究

以一种基于目标蛋白凝血酶的取代反应来研究核酸适体与互补核酸和核酸适体与目标蛋白之间竞争结合的热力学特性, 研究了核酸适体-互补核酸的解离反应和在目标蛋白存在下取代反应的平衡常数、标准焓变和标准熵变等热力学参数, 结果表明该取代反应是一个熵驱动的自发过程, 熵驱动从双链的核酸转变为核酸适体-目标蛋白的复合物. 该热力学研究会对核酸适体-互补核酸和核酸适体-凝血酶之间的结合过程的机理有一个更深的理解, 将有助于进一步揭示核酸与蛋白这两种生命中最关键物质之间的相互作用和关系, 为更好地理解基本的生物过程和预测设计适体生物传感器, 发展用于疾病诊断的方法有着重要的意义.     

无标记型核酸适体荧光传感器检测氯霉素的含量

建立了DNA核酸适体检测氯霉素的荧光分析新方法。将前人筛选得到的80bp的氯霉素DNA核酸适体截短至40bp,实验发现截短并不影响核酸适体与氯霉素的结合能力。40bp的DNA核酸适体与另一条互补DNA链形成双链DNA,SYBR Green I荧光染料能插入双链并有强荧光发射,加入氯霉素后,氯霉素能和DNA核酸适体形成稳定的复合物,诱导DNA双链打开,SYBR Green I释放,荧光降低。实验结果显示:在10~200μmol/L范围内,荧光降低百分数和氯霉素之间有良好线性关系,检测限为6μmol/L。     

适体荧光分析法检测养殖废水中四环素类抗生素

建立了核酸适体识别-荧光探针技术检测养殖废水中土霉素、四环素、金霉素及强力霉素4种四环素类抗生素(TCs)总残留量的新方法。两段DNA对TCs共同识别后折叠成稳定的"发卡型"双链结构,核酸染料4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)能插入"发卡"部位产生荧光信号发射,据此可实现对TCs的定量检测。在最优实验条件下,以土霉素为目标分子建立工作曲线,在10~50 nmol/L范围内,荧光强度与对应浓度呈良好线性关系,土霉素的检出限为2.3 nmol/L。用四环素、土霉素、金霉素和强力霉素分别进行加标回收实验,平均回收率为88.5%~102.3%,相对标准偏差(n=5)为3.2%~6.7%。5个养殖场水样中均有TCs检出,检出量在7.6~42.7 nmol/L之间。该方法简单、灵敏、快速,可满足养殖场废水中TCs总残留量的测定要求。     

基于核酸适配体的新型荧光纳米生物传感器用于凝血酶的测定

利用凝血酶的两条核酸适配体与凝血酶的高亲和力构建了三明治结构, 利用磁性纳米颗粒的磁性分离技术, 设计并制作了一种新型的荧光纳米生物传感器, 用其检测凝血酶. 此法对凝血酶的响应线性范围为2.24×10-11～4.03×10-9 mol/L, 其线性方程为I=0.9758×1011c-2.628, 检出限为1.0×10-11 mol/L, 对浓度为2.68×10-10 mol/L的凝血酶检测10次, 其RSD为2.56％, 测得的荧光信号稳定, 24 h后测定并无衰减, 具有很高的检测特异性和灵敏度.     

基于磁珠分离的酶联适配体检测痕量蛋白质的新型比色分析方法

以核酸适配体作为高效专一的识别/传感元件, 构建了一种新型的磁性分离和特异性捕获的检测方法. 两个适配体通过简单的生物素化修饰, 利用其与凝血酶不同位点的高亲和力形成夹心结构, 其中连接适配体的磁珠可捕获蛋白质, 加入另一个适配体及链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶后, 通过比色法实现靶蛋白检测. 该法操作简单, 分析时间短, 对凝血酶的线性响应范围为 10~80 nmol/L, 检出限为 10 nmol/L.     

基于阳离子型共轭聚合物和核酸适体的腺苷检测新方法

建立了一种基于阳离子型共轭聚合物和核酸适体的腺苷检测新方法. 荧光素修饰的短链DNA与腺苷的核酸适体部分互补, 形成双链DNA; 阳离子型共轭聚合物通过静电作用与双链DNA结合, 发生高效率的荧光共振能量转移(FRET). 加入腺苷后, 腺苷与核酸适体发生特异性结合, 导致双链DNA分解成单链, 使静电吸引力下降, 能量转移效率降低. 通过阳离子型共轭聚合物对单双链DNA的高效识别, 可快速简易地检测出腺苷.     

采用纳米金和荧光标记的适配体检测凝血酶

将荧光染料分子标记的含29个碱基的可识别凝血酶的DNA适配体非特异吸附到纳米金表面,荧光发生猝灭,加入凝血酶后,凝血酶与适配体特异性结合,使适配体空间结构发生改变,荧光染料分子远离纳米金表面,荧光恢复,因此可以实现对凝血酶的检测。实验结果表明,这种检测方法简便、快速、特异性强,检出限为0.54 nmol/L(对应样品体积为200μL)。     

基于主客体竞争模式的凝血酶适配体传感器的研究

基于β-环糊精(β-CD)主客体竞争模式,构建了开关型凝血酶适配体电化学传感器.将末端修饰了二茂铁(Fc)的核酸适配体通过与β-CD的主客体识别固定在金电极表面,当凝血酶存在时,适配体由原来的直立线状构型变为"G-四链体",远离电极表面,适配体探针的氧化还原电流强度减小,即"Signal-off".利用此效应对凝血酶进行了灵敏检测,结果表明,在5.0×10-13~5.0×10-9 mol/L浓度范围内,凝血酶的浓度与电化学响应信号呈良好的线性关系,检出限为2.0×10-13 mol/L(3σ).与其它蛋白分子相比,本方法对凝血酶蛋白的检测具有高特异性.本传感器构建简单,再生性好,为生物血清样本中凝血酶的实时高效检测提供了方法.     

An Aptamer‐Based Protein Biosensor by Detecting the Amplified Impedance Signal

A label‐free electrochemical impedance based protein biosensor was introduced by using aptamer as recognition tool. Our sensing protocol utilizes the affinity interaction between the thrombin and the self‐assembled DNA aptamer on gold electrode. This specific interaction increases the electrode interfacial electronic transfer resistance. The resistance signal is then “amplified” by using guanidine hydrochloride to denature the captured thrombin for increasing the hydrated radius of the thrombin, consequently blocking the electron transfer from solution to electrode. The sensor sensitivity is improved using this strategy and as low as 1.0×10^?14 mol L^?1 thrombin (enzymatic activity 10 U/mg) can be detected out.     

以聚硫堇为电化学探针的非标记型核酸适配体传感器

采用电聚合法制备了聚硫堇氧化还原电化学探针, 以金纳米粒子为固定核酸适配体的载体构建了非标记型核酸适配体传感器. 用电化学阻抗谱对传感器的组装过程进行了监测, 用循环伏安法和差分脉冲伏安法考察了传感器的电化学行为. 结果表明, 该传感器对凝血酶的检测在1.0 pg/mL～500 ng/mL范围内呈良好的线性关系, 相关系数为0.998, 检出限为0.38 pg/mL. 该传感器制备简单、 灵敏度高且抗干扰能力强.     

半胱氨酸封闭剂为电化学探针的非标记型核酸适配体传感器

采用半胱氨酸为封闭剂和氧化还原电化学探针,制备了一种新型的非标记型电化学核酸适配体传感器,并用于测定凝血酶。 利用电化学阻抗对传感器的组装过程进行了监测。 用循环伏安法和差分脉冲伏安法研究了该传感器的电化学行为。 探讨了凝血酶孵育时间、测试pH值对传感器响应的影响。 该传感器对凝血酶在10.0~10000 μg/L范围内呈良好的线性响应,检测限为2.47 μg/L。