荧光相图法研究脲诱导牛血清白蛋白的去折叠过程

作为从分子水平上阐明生命奥秘的中心课题之一,蛋白质的折叠问题一直受到生物化学、生物物理学和结构生物学等领域研究工作者的高度关注。在蛋白质的变性过程中,它们往往达不到完全去折叠,而是会形成不同的部分折叠中间态[1-3],这些部分折叠中间态在蛋白质折叠过程中起着重要作     

脲和盐酸胍诱导过氧化氢酶去折叠的研究

用荧光相图法分别研究了脲和盐酸胍诱导牛肝过氧化氢酶去折叠的过程。当脲 浓度从0依次增大至0.50,4.5和8.0 mol/L时,过氧化氢酶从天然四聚体依次转变 为蓬松的四聚体、部分折叠的无活性二聚体和去折叠态,而当盐酸胍浓度从0依次 变化至0.65,2.5和6.0 mol/L时,过氧化氢酶则从天然四聚体集资转变为部分折叠 的激活二聚体、部分折叠的单体和去折叠态,这表明无论是用脲还是用盐酸胍作为 变性剂,该蛋白的变性过程都符合“四态模型”,但这两种变性剂诱导该蛋白去折 叠的途径和机制有较大差异。实验结果表明荧光相图法可以检测蛋白质去折叠的中 间态。用等温滴定量去热法研究了盐酸胍诱导过氧化氢酶去折叠过程的热力学, 25.0 ℃时低浓度盐酸胍诱导该蛋白从天然四聚体转变为部分折叠的激活二聚体的 本征摩尔构象变化焓、Gibbs自由能和熵分别为-69.2 kJ·mol~(-1),6.43 kJ· mol~(-1)和-254 J·K~(-1)·mol~(-1),据此推断盐酸胍通过熵效应和静电效应来 稳定和激活该二聚体。     

荧光相图法研究猪胰腺α-淀粉酶在脲和盐酸胍溶液中的去折叠过程

用荧光相图法分别研究了脲和盐酸胍诱导的猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程。实验结果表明,当脲作为变性剂时,无论变性体系中有无还原剂2-巯基乙醇存在,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程均只出现一个部分折叠中间体,符合“三态模型”;当盐酸胍作为变性剂时,若变性体系中存在还原剂2-巯基乙醇,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程符合“三态模型”,而若变性体系中不存在还原剂2-巯基乙醇,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程会出现两个部分折叠中间态,此过程符合“四态模型”。     

脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子去折叠过程中各稳定构象态的分布和过渡

以内源荧光光谱和荧光相图法研究了脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子的去折叠过程,结果表明,当变性液中脲和盐酸胍的浓度分别约为4.0和3.0 mol/L时,卵清溶菌酶分子的去折叠过程均存在一个折叠中间态,这两个去折叠过程均符合"三态模型".在卵清溶菌酶分子"三态"去折叠过程的基础上,通过变性剂分子和卵清溶菌酶分子之间的缔合一...     

脲和盐酸胍诱导的牛碳酸酐酶B的去折叠

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效凝胶排阻色谱和激光光散射光谱研究了脲和盐酸胍诱导的牛碳酸酐酶B的去折叠.实验结果表明,在脲和盐酸胍诱导的牛碳酸酐酶B的去折叠过程中,溶液中只含有单分子牛碳酸酐酶B和二分子牛碳酸酐酶B集聚体;二分子牛碳酸酐酶B集聚体是通过单分子牛碳酸酐酶B之间的疏水和...     

盐酸胍和尿素诱导溶菌酶变性的微量热研究

应用恒温微量热技术,对盐酸胍和尿素与溶菌酶在30℃水溶液中的结合作用及造成溶菌酶变性的过程进行了研究,并根据简单结合模型,计算了它们之间的结合常数、结合自由能。用变性中点的直线外推方法求出了表观变性焓。实验结果表明,盐酸胍和尿素诱导溶菌酶变性的相互作用均分为3个阶段。溶菌酶在盐酸胍溶液中的变性焓在pH=4.16时为81...     

盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子重折叠过程及其各稳定构象态的分布和过渡

采用变性和非变性电泳、 高效凝胶排阻色谱、 内源荧光发射光谱和荧光相图以及生物活性测定等方法, 研究了盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程及此过程中卵清溶菌酶分子各稳定构象态的分布和过渡. 结果表明, 当复性液中盐酸胍浓度分别约为5.0和2.4 mol/L时, 变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程各存在1个稳定折叠中间态, 重折叠过程符合"四态模型". 在卵清溶菌酶分子四态重折叠过程基础上, 结合盐酸胍与卵清溶菌酶分子之间的缔合-解离平衡, 给出了一个定量描述变性剂诱导的蛋白质分子复性过程中蛋白质分子复性率随溶液中变性剂浓度变化的方程. 该方程包含2个特征折叠参数, 一个是蛋白质分子从一个稳定构象态过渡到另一个稳定构象态的热力学过渡平衡常数k; 另一个是在此过程中平均每个蛋白质分子所结合的变性剂分子数目m. 通过这2个特征折叠参数能够定量描述盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶完全去折叠态、 折叠中间态和天然态分子随复性液中盐酸胍浓度变化的分布和过渡情况.     

溶液中溶菌酶的荧光光谱研究

本文采用荧光分析法(荧光光谱、荧光偏振度)结合内源荧光探针色氨酸残基对溶菌酶及其在不同条件下的构象变化进行了研究。结果表明,利用荧光光谱可对溶菌酶溶液构象进行有效的分析,能够较直观地表征色氨酸残基在溶菌酶分子中的微环境及其在不同条件下构象的变化,得出了一些较有价值的结果。     

脲或盐酸胍溶液中变性溶菌酶复性过程中集聚体的研究

建立在蛋白质变性-复性三态模型的基础上, 给出了一个描述在变性液中变性蛋白质复性时蛋白质浓度和其复性率的关系式. 通过这个关系式, 可以获得两个重要的描述蛋白质变性-复性体系特征的参数, 一个是包含在一个集聚体分子中的变性蛋白质的分子数目n, 另一个是蛋白质从原始态到形成集聚体过程中的表观集聚平衡常数K. 以三种溶菌酶在脲和盐酸胍溶液中的变性-复性过程对此方程进行了验证, 结果表明所给出的方程能够很好地描述三种溶菌酶在这两种变性液中的复性结果, 三种溶菌酶在两种变性液中有形成二分子集聚体的趋势. 变性溶菌酶在复性过程中的电泳和高效凝胶排阻色谱也同时能够监测到复性过程中集聚体的形成, 并且监测结果与上述方程所得的结果一致.     

盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠过程的研究

分别用内源荧光光谱法、荧光相图法、荧光探针法、荧光猝灭法、蛋白质电泳法以及体积排阻色谱法研究了盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程. 内源荧光光谱和荧光相图结果表明, 当变性液中盐酸胍浓度约为1.0 mol/L时, 芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程中出现一个部分折叠中间体, 其去折叠过程符合“三态模型”; 荧光探针结果表明, 在溶液中盐酸胍浓度约为1.0 mol/L时, 中间态芽孢杆菌a-淀粉酶分子中存在着能够与探针分子1-苯胺 基-8-萘磺酸(ANS)结合的稳定的疏水区域; 荧光猝灭研究给出了不同程度变性的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶中的Trp的分布情况, 结果表明中间态芽孢杆菌a-淀粉酶分子中能够被碘化钾猝灭的位于分子表面的色氨酸残基数目达到最大的8个; 蛋白电泳和体积排阻色谱结果表明, 在盐酸胍诱导的芽孢杆菌a-淀粉酶分子的整个去折叠过程中, 不会以共价键或非共价键形式形成芽孢杆菌a-淀粉酶分子之间的集聚体或集聚体沉淀. 在此基础上, 对盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程进行了描述.     

Unfolding of Bovine Heart Cytochrome c Induced by Urea and Guanidine Hydrochloride

The unfolding of bovine heart cytochrome c induced by urea and guanidine hydrochloride was studied through their intrinsic fluorescence emission spectra, fluorescence phase diagrams, fluorescence quenching, size‐exclusion chromatographies, native polyacrylamide gel electrophoreses and deactivation profiles. The results showed that during their unfolding in urea and guanidine hydrochloride solutions, bovine heart cytochrome c molecules existed only in a unimolecular form and their bi‐molecular and/or poly‐molecular aggregates and aggregate precipitates were not formed all along. When the urea and guanidine hydrochloride concentrations in denaturation solution were separately about 6.0 and 3.0 mol/L, they could be completely deactivated and almost all of the tryptophan residues originally embedded in the interior of their molecules were exposed to the surface of their molecules. Different from the unfolding of the most often used horse heart cytochrome c, that of bovine heart cytochrome c induced by urea and guanidine hydrochloride was separately a completely co‐operative procedure and followed a two‐state model.     

Distribution and Transition of Native and Completely Unfolded Conformations in the Unfolding of Bovine Heart Cytochrome c Induced by Urea and Guanidine Hydrochloride

The unfolding of bovine heart cytochrome c induced by urea and guanidine hydrochloride was first studied through intrinsic fluorescence emission spectra and fluorescence phase diagram and the results showed that both of them separately followed a two‐state model. As the simplest sample of the unfolding of protein molecules induced by denaturants, an equation was presented to show the effect of the denaturant concentrations in denaturation solution on the residual activity ratios of bovine heart cytochrome c in their two‐state unfolding. There are two characteristic unfolding parameters K and m in this equation. The former is the thermodynamic equilibrium constant of the unfolding of bovine heart cytochrome c induced by denaturants, the latter is the number of denaturant molecules associated with a bovine heart cytochrome c molecule during the unfolding procedure, and through them the distribution and transition of native and completely unfolded bovine heart cytochrome c conformations under different concentrations of urea or guanidine hydrochloride in denaturation solution can be accurately described.     

牛血清蛋白在盐酸胍和尿素体系中变性的微量热研究

在30 ℃时用恒温微量热法研究了不同pH值下盐酸胍、尿素诱导牛血清蛋白变性的过程. 并用Privalov提出的简单键合模型对量热数据进行了分析, 计算了表观键合常数K, 简单键合的单个表观键合自由能ΔG和总吉布斯能ΔG(a), 用变性中点的直线外推方法求出了表观变性焓ΔH_d. 实验结果表明, 牛血清蛋白与盐酸胍的键合在碱性条件下更易进行, 牛血清蛋白在盐酸胍溶液中的变性焓ΔH_d在牛血清蛋白的pH＝6.97和7.05时为350 kJ•mol^－1, 在pH＝9.30时为275 kJ•mol^－1, 表明牛血清蛋白在接近中性时较稳定. 而牛血清蛋白与尿素的键合在酸性条件下更易进行, 此变性焓ΔH_d在牛血清蛋白的pH＝6.97时为295 kJ•mol^－1, 在pH＝7.05和9.30时为230 kJ•mol^－1. 此结果说明牛血清蛋白在两种变性剂溶液中的展开程度是不同的.     

Phase Diagram of R(+)-S(-) Efaroxan Hydrochloride

The phase diagram of R(+)-S(-) efaroxan hydrochloride (T_fus.(R)=245.1±0.3°C. ΔH_fus.(R)=119.6±3.0 J g^-1) shows a racemic compound. The melting temperature and melting enthalpy of the compound are: T_fus.(RS)=247.8±0.2°C and ΔH_fus. (RS)=124.6±2.4 J g^-1. A solid ↔ solid transformation takes place at T_trs.=180±1°C, ΔH_trs.=15.0±0.4 J g^-1. This transition is observed between 3 and 97% R(+). The stability of the racemic compound already established in a previous study was confirmed by the value of Petterson's coefficient (i=1.19). The two eutectic positions at 20 and 80% R(+) that define the range over which the racemic compound is found, exclude the use of resolution methods by preferential crystallization. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

荧光光谱法研究牛血清蛋白在盐酸胍体系中的变性

应用荧光光谱技术,对盐酸胍与牛血清蛋白在30℃水溶液中的结合作用及造成牛血清蛋白变性的过程进行了研究,考察了盐酸胍诱导牛血清蛋白变性时荧光强度和峰位的变化规律,并计算出伸展分数fu,变性平衡常数Ku,伸展吉布斯自由能△Gu,衡量蛋白质对变性剂稳定性的参量△GH2o,衡量蛋白质变性协同性的参量m和变性中点C1/2.研究结...