褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著;而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.     

褶纹冠蚌硫氧还蛋白基因克隆及空间结构分析

运用RACE-PCR方法从褶纹冠蚌血细胞中克隆出硫氧还蛋白(Trx)的cDNA。结果表明褶纹冠蚌TrxcDNA序列全长为1 169bp,其中5′非编码区(UTR)长11bp,3′非编码区长840bp,含有PolyA尾和典型的腺苷酸信号序列AATAAA,开放阅读框长度为318bp,编码105个氨基酸。预测蛋白质分子量为11.6kDa,等电点为5.38,未发现有信号肽。氨基酸序列中含有1个Thioredoxin结构域(T3-K104),区域内包含一个保守的CGPC活化位点。序列同源性比较结果显示褶纹冠蚌Trx与太平洋牡蛎和紫贻贝的氨基酸序列一致性分别为56%、52%。预测的Trx空间结构由5个β折叠和4个α-螺旋组成,α-螺旋包围β折叠形成紧密的球形,这一结构与人的Trx空间结构相似。     

褶纹冠蚌内4种蚌螨的时空生态位分析

对鄱阳湖地区4种蚌螨在褶纹冠蚌(Cristaria plicata)内的生态位宽度和生态位重叠进行了研究。结果表明,褶纹冠蚌内弯弓蚌螨(Unionicola arcuata)种群数量最大,丰盛度为20.26±50.00;丫纹蚌螨(U.ypsilophora)种群数量最小,丰盛度为0.29±1.28。弯弓蚌螨和丫纹蚌螨在外鳃分布数量最多,分别为9.031 7±20.153和0.206 3±0.975 4;簇刺蚌螨(U.penicillatus)在内鳃分布数量最多,为0.688 5±6.764;敏捷蚌螨(U.agilex)则在斧足上分布较多,为0.615 1±0.443 9。弯弓蚌螨的时间生态位宽度值最大,为0.240 7;敏捷蚌螨的宽度值最小,为0.099 6。簇刺蚌螨与弯弓蚌螨的时间生态位重叠值最大,为5.221 2;簇刺蚌螨与敏捷蚌螨之间没有时间生态位重叠。敏捷蚌螨的空间生态位宽度值最大,为0.526 7;丫纹蚌螨的宽度值最小,为0.287 8。弯弓蚌螨与丫纹蚌螨的空间生态位重叠值最大,为2.649 4;丫纹蚌螨与敏捷蚌螨的重叠值最小,为1.910 0。弯弓蚌螨的时-空二维生态位宽度值最大,为0.103 8;敏捷蚌螨的宽度值最小,为0.052 8。簇刺蚌螨与弯弓蚌螨的时-空二维生态位重叠值最大,为11.598 9;簇刺蚌螨与敏捷蚌螨之间没有时-空二维生态位重叠。褶纹冠蚌内4种蚌螨对资源的竞争可能集中在时间上;经过长期的协同进化,弯弓蚌螨较适宜在褶纹冠蚌内生存,簇刺蚌螨有可能与之发生竞争。     

褶纹冠蚌寄生蚌螨群落结构

通过对太湖、巢湖、鄱阳湖中褶纹冠蚌寄生蚌螨的感染调查，发现3个湖泊的褶纹冠蚌中有3种蚌螨寄生，但蚌螨群落组成不同。弯弓蚌螨是巢湖的绝对优势种，优势度指数为99．7％；太湖的优势种是Y纹蚌螨，优势度指数70．3％，次优势种为弯弓蚌螨，优势度指数23．4％；鄱阳湖优势种是Unionicola spp，优势度指数52．4％，次优势种为弯弓蚌螨，优势度指数29.5％。蚌螨在宿主褶纹冠蚌内都呈聚集分布，但3个湖泊中不同种寄生蚌螨的分布参数不同，说明其聚集强度不同。利用卡方对种间关联关系进行检验，结果表明鄱阳湖中Y纹蚌螨与弯弓蚌螨之间呈负关联关系（x^2=5．95〉x0.05^2 =3，84，V=-0．57），弯弓蚌螨与Unionicola spp．呈正关联关系（x^2=4．22〉x0.05^2=3．84，V=0．48）。由群落相似系数可以看出3个湖泊寄生蚌螨群落相似程度较低。     

褶纹冠蚌肝脏线粒体DNA的初步研究

对褶纹冠蚌肝脏线粒体mtDNA进行了提取,纯化,内切酶分析和电镜观察。BamHI和Bgl I单酶切结果分别产生两个和三个片段,测得其分子大小为15.49kb,分子量为9.57×10~6。电镜观察显示mtDNA呈环形,大小为15.40kb。褶纹冠蚌肝脏DNA与其它动物的mtDNA在形状和大小上相似。     

利用相差显微镜和流式细胞术分析褶纹冠蚌血细胞类型

利用相差显微镜对褶纹冠蚌的血细胞进行了观察,结果发现颗粒细胞和无颗粒细胞两大类。颗粒细胞还可以根据细胞和颗粒的大小分为大颗粒细胞和小颗粒细胞,无颗粒细胞也可以根据细胞的大小和细胞的核质比分为透明细胞和淋巴样细胞。另外,利用流式细胞仪进一步分析了褶纹冠蚌血细胞的类群。通过测试前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)两个参数,分别代表细胞的大小和细胞的颗粒度,绘制双参数(SSC×FSC)点图和等高图,FSC和SSC单参数直方图,得出褶纹冠蚌血细胞可以分为两大群,即颗粒细胞(A)和无颗粒细胞(B)两种类型,其中颗粒细胞群可以划为两个亚群,即大颗粒细胞(A1)和小颗粒细胞(A2),无颗粒细胞群也可以划为两个亚群,即透明细胞(B2)和淋巴样细胞(B1)。在四种血细胞中,小颗粒细胞和透明细胞是主要的细胞类群,分别占血细胞总数的56.54%和35.90%,而大颗粒细胞和淋巴样细胞数量较少,分别为4.57%和2.99%。     

弯弓蚌螨(Unionicola arcuata)线粒体12 S rRNA基因的序列分析

用线粒体12 S rRNA基因特异性引物,对鄱阳湖地区褶纹冠蚌内弯弓蚌螨的线粒体12 S rRNA基因进行PCR扩增和双向测序,经校对拼接后,获得全长为648 bp的弯弓蚌螨12 S rRNA基因全序列。A、T、G、C 4种碱基的平均含量分别为49.1%、25.6%、8.5%、16.8%,平均A+T含量(74.7%)明显高于G+C     

褶纹冠蚌(Cristaria plicata)热休克蛋白70的原核表达及多克隆抗体制备

构建褶纹冠蚌热休克蛋白70基因的原核表达质粒pET30a-cpHSP70,并经酶切和DAN测序鉴定。将其转入到表达宿主BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western-blot检测。结果显示:新表达的重组蛋白分子量约为74kD。在IPTG的诱导下,其表达量随时间的增加而增加,最适表达条件是37℃诱导8h。表达蛋白可溶性分析发现,一部分蛋白以不溶性的包涵体形式存在,一部分蛋白以可溶性蛋白形式存在。Westernblot检测显示蚌在35℃热激诱导1h后,其血、鳃、肌肉、肝胰腺和外套膜组织cpHSP70蛋白表达水平相对于蚌在20℃暂养3h后的表达量明显升高。     

柱状黄杆菌对褶纹冠蚌抗氧化系统主要因子的影响

利用柱状黄杆菌为刺激物,对褶纹冠蚌进行注射感染,在注射后3、6、12、24、48h后分别取血清、肝胰腺,测定其超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性和谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)的含量的变化。结果表明,经柱状黄杆菌感染后,实验组血清中的SOD活性在6h时与对照组有显著性差异;GPX的活力在3h与对照组有明显的差异,GSH的含量在24h明显低于对照组。而实验组肝胰腺中GPX的活力在24和48h时显著高于对照组。实验组血清和肝胰腺中MDA和H2O2的含量与对照组没有明显的差异。褶纹冠蚌注射柱状黄杆菌感染后,血清中各抗氧化指标比肝胰腺中的变化大。更多还原     

重金属对褶纹冠蚌Cu/ZnSOD基因mRNA表达和酶活性的影响

为研究重金属离子对褶纹冠Cu/ZnSOD基因mRNA表达和酶活性的影响,采用Cd2+,Cu2+和Pb2+单一胁迫褶纹冠蚌72h,检测0,6,12,24,48和72h,Cu/ZnSODmRNA表达和酶活性的变化。结果表明:在Cd2+胁迫下,Cu/ZnSODmRNA表达量及酶活性均随暴露时间延长而逐渐升高,72h达到峰值,且48和72h均显著性高于对照组(P<0.05);在Cu2+胁迫下,Cu/ZnSOD mRNA表达量及酶活性具有先升高后降低的趋势,12h两者达到峰值,其中,Cu/ZnSOD mRNA表达量在12h显著高于对照组(P<0.05),Cu/ZnSOD酶活性在6,24,48和72h的表达量均显著高于对照组(P<0.05);Pb2+胁迫与Cu2+胁迫趋势相似,Cu/ZnSODmRNA表达量及酶活性均在48h达到峰值,Cu/ZnSODmRNA表达量在24,48和72h显著性高于对照组(P<0.05),Cu/ZnSOD酶活性在48和72h的表达量均显著高于对照组(P<0.05)。说明褶纹冠蚌内脏团中Cu/ZnSODmRNA和酶可以作为生物标志物对水环境中的重金属污染进行检测。     

坛紫菜hsp70基因克隆与表达

HSP70家族是一类最保守和最重要的热应激蛋白家族,在藻类中编码HSP70家族的基因也是普遍存在的,从原始单细胞藻到多细胞的大型藻,hsp70基因在藻类适应环境的过程中起了重要的作用.为了进一步探讨hsp70基因的生物学作用及其在系统进化中的保守性,研究采用简并PCR,扩增获得了坛紫菜(Porphyra haitanensis)hsp70基因片段,随后利用基因组步移获取了坛紫菜hsp70基因全序列.该基因全长2449个碱基,其中1866bp为编码区域,共编码621个氨基酸,与同属紫菜(P.purpurea)hsp70的氨基酸一致性达90%以上.利用Real-time PCR技术研究热激及恢复过程中坛紫菜hsp70的表达情况,结果表明:坛紫菜hsp70对热激应答极为迅速,35℃热激15 min,hsp70 mRNA的表达就提升了15倍;在恢复培养3 h后坛紫菜hsp70的表达进入第二个高峰,表达量提升了48倍,且在随后的过程中始终高于对照值.在整个热激处理中,坛紫菜HSP70蛋白除了作为胁迫的应激蛋白外,始终作为重要因素参与了防御与损伤修复的过程.     

鹌鹑和黑斑蛙核糖体蛋白L15 cDNA片段的克隆和序列分析

通过R-PCR方法、分别从两栖类的黑斑蛙(Rana nigromaculata)和鸟类的鹌鹑(Coturnix coturnix japonica)中首次克隆了核糖体大亚基蛋白Ll5(RPL15ribosomal protein L15)的cDNA片段,并分析了其序列特征,黑斑蛙和鹌鹑的rpll5cDNA片段分别为467个核苷酸和408个核苷酸，推测分别编码155个氨基酸和136个氨基酸的蛋白片段，与其它已知的脊椎动物，rpl15序列有高度的同源性．应用这两条cDNA序列和其它已知的脊椎动物rpll5序列构建的系统发育树显示聚类结果与传统分类一致。     

耐热酵母菌株HU-TY-1的耐热机理初探

以酿酒酵母耐热菌株HU-TY-1和亲株LK为材料,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术,对它们在热休克应答前后的耐热性及蛋白图谱进行了分析,发现两个菌株经温和高温(37 ℃)诱导后可大幅提高对致死温度(53 ℃)的耐受力,同时伴随着分子量为72 kD和84 kD的热击蛋白(HSP)的合成,其中耐热株HU-TY-1在常态时就有这两种热击蛋白的少量表达.由此表明:耐热酵母菌株HU-TY-1的高耐热性与HSP72和HSP84的组成性合成密切相关.     

草鱼IFI58基因的鉴定及其表达分析

草鱼IFI58全长cDNA为1764 bp,其中ORF为1440 bp,编码1个479 aa的蛋白。草鱼IFI58包含有10个TPR 34肽结构域,并与哺乳类IFIT相对应。其中,TPR7被中间插入序列分为TPR7A和B,TPR4也有5个氨基酸插入,TPR3只有B部分而缺少A部分。鱼类IFI基因与哺乳类的同源性不高,系统进化树也显示它     

北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

墨胸胡蜂毒腺基因cDNA文库的构建及鉴定

从墨胸胡蜂毒腺中提取总RNA，经Oligo(dT)磁珠纯化mRNA后，用AMV反转录酶合成第一链cDNA．完成第二链cDNA合成后，过柱纯化50bp以上的片段，与载体pUC118连接，转化E．coli JM109，建立了cDNA文库．得到的780个阳性克隆中，重组率达到98．5％．大部分插入片段在500～900bp．随机挑选10个短序列测序，一个为蜂毒激肽基因序列．     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

泥蚶卵黄原蛋白基因的克隆及其在Pb胁迫下的表达特征

1.宁波大学 海洋学院, 浙江 宁波 315211; 2.浙江万里学院 浙江省水产种质资源高效利用重点实验室, 浙江 宁波 315100