呋喃它酮代谢物时间分辨荧光免疫分析法的建立与应用

建立了Eu3+标记的间接竞争时间分辨荧光免疫分析法( Indirect competitive time-resolved fluoroimmu-noassay , ic-TRFIA)用于鱼肉样品中呋喃它酮代谢物AMOZ的检测。通过单因素实验考察了包被抗原浓度、抗体稀释倍数、竞争反应时间等参数对方法灵敏度的影响。结果表明,ic-TRFIA的最佳反应条件为：包被抗原浓度为0.25μg/mL,抗体稀释5×104倍,最佳竞争时间为50 min。在优化的条件下,方法的检出限( LOD, IC10)为0.01 ng/mL,半抑制浓度(IC50)为0.26 ng/mL,线性范围(IC20~IC80)为0.025~2.83 ng/mL,对鱼样中AMOZ回收率在78.0%~86.0%之间,各样品变异系数均小于15%,与HPLC-MS/MS对比检测结果显示相关性良好。本方法灵敏度高、特异性好,能够满足实际样品的检测需求。     

化学发光酶免疫分析测定鱼肉中呋喃它酮代谢物方法研究

建立了呋喃它酮代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-6唑烷基酮(AMOZ)间接竞争化学发光酶免疫分析(icCLEIA)检测方法,通过单因素实验优化了包被原浓度、抗体稀释倍数、反应缓冲体系及浓度、竞争反应时间等参数,结果表明icCLEIA最佳反应条件为:包被抗原浓度为10 ng/mL,抗体稀释60000倍,最佳竞争时间为50 min,体系缓冲液0.01 mol/L PBS(pH 7.4).在优化的条件下,本方法的线性检测范围为0.026 ～3.52 μg/L,IC50为0.29 μg/L,检出限(LOD,IC10)为0.012 μg/L.对鱼肉样品的平均添加回收率在101.4％～115.5％之间.建立的icCLEIA方法可用于实际样品中AMOZ残留检测.     

吡虫啉单克隆抗体的制备及其间接竞争化学发光酶联免疫分析方法的建立

以吡虫啉原药和3-巯基丙酸为原料,合成了吡虫啉半抗原,通过活泼酯法将其与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）偶联制备得到完全抗原,经免疫Balb/c雌性小鼠并与骨髓瘤细胞融合获得吡虫啉单克隆抗体,建立了用于吡虫啉检测的间接竞争化学发光酶联免疫分析方法（ic-CLEIA）。优化了方法的包被原稀释倍数、抗体稀释倍数、缓冲液种类、缓冲液的pH值、一抗竞争反应时间、酶标二抗稀释倍数等条件,最适条件为：包被原质量浓度62.50 ng/mL（稀释16 000倍）,抗体质量浓度103.12 ng/mL（稀释64 000倍）,缓冲液PBS（pH 7.4）,抗原与抗体竞争反应时间30 min,酶标二抗稀释倍数1∶7 000。结果表明,在最适条件下该方法的检出限（IC10）为0.03 ng/mL,IC50为0.57 ng/mL,线性检测范围（IC20 ~ IC80）为0.083 ~ 3.99 ng/mL。与氯噻啉的交叉反应率为2.2%,与噻虫胺、呋虫胺、啶虫脒、噻虫啉、噻虫嗪5种吡虫啉结构类似物无明显交叉反应。对黄瓜和苹果样品的加标回收率为82.0% ~ 112%,相对标准偏差小于15%。实际样品检测结果与HPLC仪器方法相关性良好（r2 = 0.989）。结果表明,所建立的ic-CLEIA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于食品中吡虫啉残留的快速检测。     

微板式化学发光酶免疫分析法测定人血清中癌胚抗原

采用辣根过氧化物酶(HRP)催化鲁米诺(luminol)-H2O2化学发光体系,建立了一种测定人血清中癌胚抗原(CEA)的高灵敏度、高特异性、简便快速的微板式化学发光酶免疫分析方法。对免疫反应条件、酶结合物稀释度、发光反应时间、封闭液等进行了考察和优化。采用双抗体夹心法,室温静置1h,洗涤后加入100μL发光底物液,10min后检测。该方法的线性相关系数为0.9998;最低检出限为0.57μg/L;批内和批间变异均在10%之内;低、中、高3个不同浓度值样品的平均回收率分别为107.4%、93.3%和104.5%。使用本方法与进口发光试剂盒对40份人血清样品进行测定,结果表明,本方法显示了良好的相关性,其相关系数为0.9115。表明本分析体系稳定可靠,可用于商品化诊断试剂盒的开发和应用。     

微板式化学发光酶免疫分析法临床测定人血清中孕酮

将抗兔IgG(即二抗)物理吸附于聚苯乙烯微孔板上作为通用固相,通过免疫反应制备固相抗体。采用辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系,建立了一种高通量、简便、快速的化学发光酶免疫分析方法用于临床测定人血清中的孕酮。对各种影响因素如免疫试剂的稀释度、发光底物选择、发光反应时间及温育条件等进行了考察和优化,最终选定的实验条件:孕酮抗体和HRP标记物的最佳稀释度分别为1∶100000和1∶15000;选用Ⅱ号发光底物,发光反应10min后测定;37℃水浴条件下温育1h。对建立的方法进行了评价。该方法的灵敏度为0.08μg/L;批内和批间相对标准偏差均在15%之内;低、中、高3个不同浓度值样品的平均回收率分别为101%、101%和94.4%(在87.8%～108%之间)。使用本方法和经典的放射免疫法同时对36份人血清样品进行测定,结果显示,本方法与放射免疫分析方法相关性良好,其相关系数为0.9502。     

保健食品中西地那非化学发光免疫分析方法研究

针对保健食品中西地那非药物的非法添加问题,该研究采用辣根过氧化物酶（HRP）与鲁米诺为信号输出系统,结合直接竞争模式探索了保健食品中西地那非的直接竞争化学发光酶免疫分析方法。基于特异性多克隆抗体,通过逐步优化策略,确定最佳免疫分析条件为：包被原质量浓度为41.67 ng/mL,酶标抗体质量浓度为1.25 μg/mL,封闭液和洗涤液的吐温－20含量为0.05%,稀释液的甲醇添加量为5%,竞争反应时间为40 min。在该条件下,建立了西地那非的直接竞争化学发光免疫分析方法,该方法对西地那非的半抑制浓度（IC50）为0.17 ng/mL,线性检测范围（IC20～IC80）为0.024 ~ 1.21 ng/mL,检出限（IC10,LOD）为0.008 ng/mL。与他达那非等功能类似物无显著交叉;西地那非样品的加标回收率为82.0%～114%,相对标准偏差均小于15%。盲样检测结果与HPLC－MS/MS确证方法具有良好一致性,说明该方法准确可靠,适用于样品中西地那非的快速筛查。     

化学发光免疫分析法检测血清中前列腺特异抗原复合物

采用杂交瘤技术构建抗前列腺特异抗原-α1-抗胰凝乳蛋白酶( Prostate specific antigen-α1-antichymot-rypsin complex,PSA-ACT)单克隆抗体(单抗)细胞株,共获得8株稳定分泌PSA-ACT单抗的细胞株,纯化后进行免疫特性鉴定并做单抗配对。选择其中一对单抗,采用辣根过氧化物酶( HRP)催化鲁米诺( lumino)-H2 O2化学发光体系,建立了测定人血清中PSA-ACT浓度的化学发光酶免疫分析方法( CLEIA)。对包被缓冲液、包被抗体浓度、酶标抗体稀释度、温育时间、发光反应时间和免疫反应步骤等实验参数进行了优化。在最佳实验条件下, PSA-ACT浓度在5~40 ng/mL范围内线性关系良好(R2=0.9943),检出限为0.53 ng/mL,批内相对标准偏差(RSD)为4.6%~6.6%,批间RSD为5.7%~8.0%,回收率为95.4%~104.2%,与游离前列腺特异性抗原F-PSA的交叉反应率为0.6%。本方法简单、稳定、灵敏、快速,为开发检测PSA-ACT的CLEIA试剂盒奠定了基础。     

化学发光酶免疫法检测猪肉中氯丙嗪残留

采用棋盘滴定法确定包被抗原浓度和抗体稀释倍数,通过单因素实验优化了竞争反应时间、磷酸盐缓冲液浓度、甲醇含量、pH值等参数,建立了氯丙嗪的间接竞争化学发光酶免疫检测方法,并考察了方法的特异性、灵敏度和稳定性.结果表明,最佳反应条件为包被抗原浓度为0.05 μg/L;氯丙嗪抗体稀释32000倍;体系缓冲液为含10％甲醇、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0).本方法的IC50为0.12 μg/L;检出限为0.02 μg/L;线性范围0.02～24.78 μg/L;批内和批间相对标准偏差均小于10％.与其它结构类似物没有明显交叉反应.猪肉检测的平均回收率为87.4％～105.6％,与高效液相色谱方法的相关性良好.本方法具有较高的灵敏度和较好的稳定性.     

基于抗原包被的微孔板式化学发光酶免疫分析法测定人尿中的雌三醇

将雌三醇-6-(O-羧甲基)肟(E3-6-CMO)与牛血清白蛋白(BSA)形成的偶联物E3-6-CMO-BSA物理吸附于聚苯乙烯微孔板孔内作为固相抗原,与雌三醇(E3)标准溶液或者水解尿样中待测E3通过竞争法进行免疫反应.以对碘苯酚增强的辣根过氧化物酶(HRP)催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系作为信号检测系统,建立了一种高通量、简便快速、灵敏稳定的化学发光酶免疫分析方法用于测定人尿中E3的含量.考察和优化了包被液的酸碱性、抗原包被浓度、酶标抗体稀释比例及用量、温育时间、化学发光底物用量及化学发光反应时间的影响.在最优实验条件下,方法的灵敏度为0.20ng/mL,批内和批间变异系数均在15%之内,低、中、高浓度加标水解尿样的平均回收率分别为107.9%、100.9%和91.2%.使用抗原包被法和抗体包被法同时对10份水解尿样进行测定,结果显示相关性良好,相关系数为0.9984,表明本方法可以满足临床检测的要求.     

毛细管电泳流动注射化学发光检测辣根过氧化物酶及其在免疫分析中的应用

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是从植物辣根中提取出来的一种由无色的酶蛋白和深棕色的卟啉结合而成的糖蛋白,能催化鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)及其衍生物而发光.     

对硫磷化学发光酶联免疫吸附分析方法的建立和评价

建立了基于多克隆抗体的对硫磷间接竞争化学发光酶联免疫吸附分析方法(icCLEIA)。以三氯硫磷为原料,经三步取代反应合成对硫磷半抗原,通过活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原和包被抗原。经免疫新西兰大白兔,获得对硫磷抗血清。通过优化条件参数,建立了对硫磷的icCLEIA分析方法。本方法的检测线性范围为0.24～15.83!g/L;半抑制浓度IC50为1.14!g/L;检出限为0.09!g/L;对蔬菜样品和水样品的平均添加回收率为74.6%～121.0%。本方法可用于实际样品中痕量对硫磷残留检测。     

细交链格孢菌酮酸间接竞争酶联免疫检测方法及配套试剂盒的研制

建立了间接竞争酶联免疫吸附法检测食品中细交链格孢酮酸(Tenuazonic Acid,TA)残留,并研制快速检测试剂盒。采用肟化法对TA进行衍生化,活泼酯法偶联半抗原和载体蛋白得到人工抗原TAO-BSA和TAO-KLH,以TAO-KLH作为免疫原免疫雌性Balb/c小鼠制备特异性抗体。对包被浓度、包被时间、封闭液类型、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等参数进行研究,建立了TA残留间接竞争酶联免疫检测方法并进行了配套试剂盒的研制。该试剂盒半抑制浓度Ic_(50)为1.48ng/mL,检测线性范围为0.06~35.95ng/mL(R~2=0.9941);检测限为0.02ng/mL;加标样品平均回收率大于88.50%;试剂盒的批间和批内平均变异系数分别为2.84%和9.49%,与食品中常见真菌毒素交叉反应率均小于1%。     

酱油与白酒中邻苯二甲酸二甲酯的化学发光酶免疫分析方法研究

本研究以邻苯二甲酸二甲酯( DMP)为研究目标,以4-氨基邻苯二甲酸二甲酯为半抗原,通过重氮化法偶联载体蛋白并免疫动物,制备针对DMP的特异性兔多克隆抗体。通过棋盘滴定法和单因素实验确定最佳的实验参数,即包被原浓度为50μg/L,一抗浓度为92.5μg/L,二抗浓度为1μg/mL,药物稀释液为pH 6.0的纯水,竞争反应时间为40 min,基于此建立了间接竞争化学发光酶联免疫分析法检测DMP。本方法对DMP的检出限为0.29μg/L,线性检测范围为0.74~30.32μg/L,与13种结构和功能类似物的交叉反应率均<5%,通过倍比稀释降低白酒、酱油样品基质干扰,对样品的平均回收率在80.2%~116.0%之间,平均相对标准偏差<3.6%,结果与GC-MS法的测定结果相符。本方法适用于食品样品中DMP的快速检测。     

增强化学发光体系酶联免疫分析法测定人绒毛膜促性腺激素

应用活化鲁米诺,用优化的增强化学发光酶联免疫分析体系测定人绒毛膜促性腺激素,检测限为0.2mIU/ml。线性范围0～200mIU/ml,与放射免分析测定结果比较,相关性良好。进而又发展了一种半定量的照相测定法,通过实际血清样品测定,效果良好。     

增强化学发光酶免疫分析法测定血清中的铁蛋白

本文采用对碘苯酚增强的Ｌｕｍｉｎｏｌ－Ｈ２Ｏ２－ＨＲＰ化学发光反应体系作为免疫分析的最终检测手段，建立了一种新的铁蛋白的免疫分析方法，与酶联免疫分析法相比，该方法具有灵敏度高，线性范围宽等特点。方法的相对标准偏差３．７％，标准曲线线性范围为０．１２－２０００ｎｇ／ｍｌ，用该方法对血清中的铁蛋白进行了测定，其结果与ＥＬＩＳＡ法所得结果一致。     

Micro-Plate Chemiluminescence Enzyme Immunoassay for Determination of Zeranol in Bovine Milk and Urine

Zeranol (α-Zearalanol, α-ZAL), well-known as an anabolic promoter, was officially banned in Europe due to its potential carcinogenic and endocrine-disrupting biological activities. In this study, a method for the determination of zeranol residues in bovine milk and urine was developed based on micro-plate chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA). The limit of detection (LOD) was 50 ng/L, and the linear range was between 100 ng/L and 4510 ng/L, with a correlation coefficient (R²)0.9982. The recoveries of zeranol in bovine milk and urine were between 84.7% and 123.6%. This study showed that CLEIA was a reliable, convenient, and sensitive method for screening zeranol residues in bovine milk and urine.