人工促使细胞间细胞质和染色质穿壁转移实现外源遗传物质导入途径的研究

我们建立的一项新的细胞工程技术(L.B.技术)是用物理和化学方法促使不同亲本细胞间建立联结和通道,进而迫使镶嵌生长在一起的两亲本细胞间细胞质和染色质从细胞壁的一处或几处,以不同的质和量通过扩大了的胞间通道“穿入”或通过因细胞壁形成过程中不均匀生长和加厚并经L.B.技术处理而出现的薄弱区域或孔穴“穿入”相邻细胞,实现植物细胞对外源遗传物质或基因群的导入.不同的细胞生长发育区域的细胞间及同一生长发育区域细胞间穿壁转移的方式、频率、强度也是不同的.导入的历程和途径是,镶嵌生长在一起的两亲本细胞团,经低渗低pH值K~+溶液处理后,细胞吸水膨胀,原生质和核液川流增强,细胞壁松弛,壁上通道扩大,并在壁上薄弱区域形成更多的孔穴,这些造成了穿壁的良好结构和生理状态,渗透压和离心力则是实际驱动力,促使细胞质和染色质大量而强烈地穿壁转移,实现外源遗传物质的导入.     

ACHT促使次生胞间连丝和胞间通道的形成

在应用人工促使不同细胞间细胞质和染色质穿壁转移技术的共培养期间,烟草和菠菜细胞间形成厚薄不均匀的隔离层,逐渐被吸收、变薄、直至消失,使不同的细胞直接联结嵌合在一起;在继续共培养时,相邻细胞壁上,从一侧或两侧形成次生半胞间连丝、胞间连丝和胞间通道(细胞融合道),从而把不同细胞联结成共质细胞团,为进一步适时地操作细胞质和染色质的穿壁转移提供了细胞结构和细胞生理基础。本文描述了细胞间各种类型的联结和通道。     

从棒头草(Polypogon fugax Nees ex Steud)原生质体培养获得再生成熟植株

本文报道从棒头草(Polypogon fugax Nees ex Steud)原生质体培养获得体细胞胚和再生成熟植株的试验结果。从悬浮细胞制备的原生质体,经培养获得了再生小植株;而从胚性愈伤组织直接制备的原生质体,经培养已再生了成熟植株,后一条途径为其他禾本科植物原生质体培养提供了新的线索,本文还对有关的培养方法和培养基进行了研究。     

小麦原生质体再生细胞直接形成体细胞胚和再生植株

本文用普通小麦品种“济南177”幼胚诱导产生的胚性愈伤组织为材料游离原生质体,培养在附加有1mg/12,4-D和500mg/1水解酪蛋白(CH)的NMB培养基中,原生质体再生细胞直接分裂成为体细胞胚。生长至1.5—2mm大小的体细胞胚在无激素的MB固体培养基上直接发育成为完整再生小植株。     

小麦原生质体培养——高频率的细胞团形成和植株再生

通过调整培养基中还原态氮的含量及变換使用不同水平的2,4-D,从普通小麦的成熟种子诱导建立了胚性愈伤组织无性系,随后又从中诱导出了适合悬浮培养的松脆愈伤组织,并建立了悬浮系。由悬浮细胞游离原生质体,培养于KM8P等几种培养基中,获得了大量的再生细胞团。变换使用不同的培养基使细胞团进一步发育,形成了致密的或颗粒状的愈伤组织,在分化培养基上以器官发生和胚胎发生的途径形成了完整的植株。     

小麦胚性非再生细胞中游离氨基酸分析

利用毛细管电泳技术分析了小麦胚性非再生细胞中游离氨基酸的组成与含量。与已经发表的胚性再生细胞游离氨基酸浓度比较发现，两类胚性细胞中游离氨基酸的含量差异明显：在9种可以分开的游离氨基酸中，胚性再生细胞中的游离精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸分别是胚性非再生细胞中的10、3、2和2倍，其它氨基酸的浓度在两类细胞中没有明显的变化。本研究不但为检测植物细胞氨基酸成分提供了方便快捷的方法，而且为进一步探索小麦两类胚性细胞在分子水平上的差异和形成机理提供了生化基础。     

大豆(Glycine max(L.)Merr.)未成熟子叶组织的体细胞胚胎诱导和植株再生的研究

本文利用大豆未成熟子叶作外植体,进行大豆体外培养并诱导体细胞胚胎形成和植株再生的研究。结果表明,高浓度生长素10mg/l NAA或5mg/l 2,4-D是大豆体细胞胚胎形成的先决条件。附加10mg/1 NAA的Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)能够直接在子叶表面诱导体细胞胚的形成,其频率可达85％;附加5mg/l 2,4-D的MS培养基首先诱导未成熟子叶产生胚性愈伤组织,然后产生大量体细胞胚,频率高达94％。我们成功地获得再生的大豆完整小植株15株,消除了大豆基因工程的障碍之一。     

从三叶半夏(Pinellia ternata Breit)叶肉原生质体再生植株

从三叶半夏叶片分离到大量、具活力的叶肉原生质体,采用无机盐、激素、蔗糖浓度不同的液体和固体双层培养基培养。4—7天内原生质体出现第一次分裂,分裂频率为3—8％,3周后形成80—100个细胞的细胞团,转入液体培养基中振荡培养,1月后将形成1—2mm直径的愈伤组织再转入固体分化培养基中,愈伤组织先增殖、生长,3—4周后分化出绿芽和小苗,再1月后,由原生质体再生的半夏小植株已长至6—10cm高。半夏原生质体再生植株的发生途径有器官型和胚状体型两种方式。比较和讨论了悬浮培养、双层培养和组份浓度差液-固体双层培养对原生质体培养的效果。     

抗4-氧赖氨酸的烟草愈伤组织突变体及其再生植株组织的研究

本文用烟草叶片发生的愈伤组织,相继用L-4-氧赖氨酸(OL,1克/升),2％甲基磺酸乙酯(EMS)和OL(4克/升)处理,选择并建立了抗OL的烟草愈伤组织突变体(W_0),它对乙硫氨酸(Eth)和5-甲基色氨酸(5MT)不表现交叉抗性。它比其亲本积累赖氨酸多一倍。从它再生出突变植株,在培养瓶内开花结籽。从突变植株发生次级愈伤组织(BCB)。检查了W_0和BCB对OL的抗性,赖氨酸含量和过氧化物酶同工酶谱带,证实与其亲本不同的上述三项特征都能通过再生传递在次级愈伤组织培养上表达。     

大豆原生质体经体细胞胚再生植株

从栽培大豆(Glycine max L)的未成熟子叶游离的原生质体,以Gelrite bead法包埋,培养在大豆根瘤产物(天冬酰胺、谷氨酰胺、尿囊素、尿囊酸等)为主要氮源的ZSP培养基中,形成了胚性愈伤组织。该愈伤组织在体细胞胚分化培养基上直接分化出体细胞胚,并进一步诱导出再生植株,进入正常发育而开花。     

桑树花药培养获得单倍体植株

本文取花粉发育为单核至单核靠边期的花药,接种于脱分化培养基,28℃黑暗培养15日,后每日用2000 Lux光照12h,35日后形成胚状体,其诱导率可达13.6％;当胚状体长至3mm,颜色开始转绿后转移至分化培养基,分化绿苗率可达37.21％;在苗高2—3cm时于基部切下,置发根培养基处理2—4日后转移至无激素培养基培养,发根率可高达95％以上;胚状体的染色体数均为单倍体(n=14),经植株幼叶染色体鉴定,成功地获得了桑树单倍体值株。     

黑麦B染色体起源的研究

本文采用压片法和Giemsa C带技术,重点地研究了黑麦花粉母细胞凝线期染色质穿壁运动之后,所产生的额外的带着丝粒断片的形态结构、归属和细胞学行为,及其可能的来源。结果表明,额外的带着丝粒断片的结构各异,有中部着丝粒的、亚中部着丝粒的、端部或亚端部着丝粒的。它们的来源是随机的,任何染色体都有成为这种断片的可能性。额外的带着丝粒断片的细胞学行为与B染色体的行为一致。作者认为,额外的带着丝粒的断片就是B染色体,它们是凝线期染色质穿壁时由A染色体断裂而来,因此认为,细胞融合是B染色体的来源之一。     

镧、铈和铽作用于细胞的靶点差异

稀土可通过食物链进入生命体并累积已成为不争的事实,但稀土离子的植物细胞化学行为尚不清楚.本文通过~(140)La(Ⅲ)、~(141)Ce(Ⅲ)、~(160)Tb(Ⅲ)在植物体内放射自显影技术和量子化学计算等研究发现,化学性质相似的稀土离子La(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)、Tb(Ⅲ)在细胞质膜和质膜外作用靶点显著不同,即Ce(Ⅲ)主要与质膜物质发生键合,La(Ⅲ)还能与细胞质膜外的细胞外物质和胞外基质分子键合,Tb(Ⅲ)更可与细胞壁物质键合;La(Ⅲ)和Tb(Ⅲ)与胞吞作用进入细胞的物质发生键合而进入细胞,Ce(Ⅲ)尚未观察到此现象;La(Ⅲ)和Tb(Ⅲ)与细胞质膜和质膜外物质通过配位共价键及分子间氢键形成稳定的路易斯酸碱配合物,Ce(Ⅲ)则可能仅靠库仑力与细胞质膜物质发生作用.由此导致La(Ⅲ)、Ce(Ⅲ)、Tb(Ⅲ)3种离子对细胞的作用靶点具有明显选择性,其中Ce(Ⅲ)的选择性La(Ⅲ)Tb(Ⅲ).可见,3种稀土离子不同数量f电子的成键活性所致细胞质膜及膜外靶分子键长、键角等参数差异,将导致下游信号转导及细胞化学行为迥异,终致其毒理不同.本文结果可为科学探究稀土累积对生物危害的细胞学机理提供新的思考与借鉴,也为稀土食品安全及人类健康预防提供重要指导.     

生物化学工程述评

生物技术和生物医学近10年来的迅速发展,为化学专家提供了大量的新技术和机会。在与人类健康有关的重要领域,已能设计和制造人造脏器、诊断试剂以及治疗药物;在农业上,能够制造兽药、培养植物细胞、利用基因工程和细胞工程技术获得抗病毒、抗虫、     

人参花粉植株的诱导及体细胞无性系的建立

人参花药培养已连续四年(1981—1984年)得到了花粉植株,并建立了体细胞无性系。人参花药对培养基的适应较广,在MS等6种基本培养基上都得到了愈伤组织;低温预处理能明显提高诱导效果;已筛选出愈伤组织诱导率高的培养基配方,再生植株的分化比较困难,在100多种分化培养基配方中筛选出16种能分化再生植株的配方,分化率高的可达6.8％。经二年多16次继代培养,建立了能保持良好分化能力的体细胞无性系。     

细胞内不同形态Gd基MRI造影剂的T1/T2弛豫性能及造影效果

将具有良好生物膜穿透性的异烟肼(INH)和Gd-DO3A偶联,合成了小分子MRI造影剂Gd-DO3A-INH;利用脉冲电转染技术标记间充质干细胞,有效提高了进入细胞的Gd-DO3A-INH浓度,并诱导部分游离态Gd-DO3A-INH在细胞质中自组装成纳米粒子。细胞样品的TEM观察到细胞内形成了Gd-DO3A-INH纳米粒子;细胞传代实验和体外MRI揭示了2种不同状态的Gd-DO3A-INH对细胞水质子弛豫速率的影响机制,以及细胞传代过程中细胞内2种不同状态Gd-DO3A-INH的浓度涨落引起的MRI造影效果的变化机制。     

土壤根癌杆菌体外转化胡萝卜悬浮培养细胞

本文报道了土壤根癌杆菌C58菌株体外转化胡萝卜悬浮培养单细胞。结果表明,土壤根癌杆菌可以直接转化具有完整细胞壁的高等植物细胞。在25℃下,细菌和植物细胞混合比为100(即100个细菌对1个植物细胞)时,转化频率约为10~4。虽然在转化组织及其再生植株中没有检测到胭脂碱,但被转化细胞具有激素自主性生长的能力,并且很容易再生成完整植株。此外,还比较了土壤根癌杆菌和土壤发根杆菌诱导胡萝卜圆片所形成的瘤组织和发根瘤在生长速率和再生能力方面的差异。     

基于GC-TOF/MS技术的转Bt基因大米代谢组学研究

基于GC-TOF/MS技术对来源于两个不同产地的转Bt基因及其亲本大米进行了代谢组学研究。从大米样本中共检出774个色谱峰,鉴定出278种代谢产物,包括糖、氨基酸、脂肪酸及有机酸等代谢产物。对转Bt基因及其亲本大米进行主成分分析,结果表明,转Bt基因与亲本大米的代谢组之间无明显差异性,进一步对数据进行偏最小二乘判别分析和方差分析,仅甘油和鼠李糖两种代谢产物浓度在转Bt基因大米及其亲本大米间存在一定差异(分别升高1.55和3.32倍);考察了不同产地对大米代谢组的影响,结果表明武汉和海南两个产地的大米代谢组之间存在明显差异,有15种代谢产物在不同产地的亲本大米之间以及不同产地的转基因大米之间均发生显著变化。应用GC-TOF/MS技术对来源于不同产地的转Bt基因大米及其亲本大米的代谢组进行比较研究,结果表明引入外源Bt基因对实验中的水稻机体内代谢未产生明显影响,产地差异造成的大米间代谢组差异比引入外源Bt基因造成的大米间代谢组差异更为显著。     

水稻雄性不育系C1001中发现无融合生殖株系的细胞学和胚胎学研究

对水稻雄性不育系C1001的生殖方式进行的细胞学和胚胎学研究表明,在水稻雄性不育系C1001的部分株系中,其生殖方式出现了几种类型的无融合生殖,在完全隔离的条件下,在胚珠内观察到有两条胚的可能发生途径,其一,胚来自胚珠体细胞(因尚未追溯其来源,暂定为胚来自胚珠体细胞),然后挤向胚囊继续发育成成熟胚;其二,胚来自未授精的卵细胞或助细胞,以孤雌或单性生殖的方式发育成胚,不形成真正的胚乳,此外反足细胞发生位移,细胞质变稀薄,液泡化,并进行有丝分裂,形成多细胞结构,讨论了水稻C1001中发生的无融合生殖方式和意义。     

高等植物根原生质体的分离和培养

本文由12种植物,其中包括8种豆科植物(绿豆、黑绿豆、大豆、豌豆、木豆、蚕豆、苜蓿和胡卢巴)和4种十字花科植物(油菜、本油菜、甘兰和白芥)的萌发种子的幼根分离得到了根原生质体.根原生质体在培养中表现出活跃的分裂能力.除了在木豆和蚕豆中仅观察到细胞分裂外,其余10种植物的根原生质体均形成了愈伤组织。其中苜蓿根原生质体通过形成胚状体再生了植株,而油菜和甘兰的根原生质体通过愈伤组织诱导成芽也再生了植株,由此证明了根原生质体的全能性.这为那些在分离或培养原生质体方面仍存在困难的植物种提供了另一可供选择的系统.本文还讨论了这一系统的优点以及存在的问题。