新型冠状病毒S蛋白在金纳米粒子中的表面增强拉曼效应

表面增强拉曼光谱技术因其高灵敏度、操作简单、快速检测等优点,被广泛用于病毒检测方面。国内外的病毒拉曼检测研究主要集中在检测病毒核酸以及组成核酸的各种碱基的表面增强拉曼光谱(SERS),但少见对病毒蛋白的SERS检测。以新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的S蛋白为检测对象,采用无标记SERS检测方法,对比SARS-CoV-2固态、饱和液态S蛋白的普通拉曼光谱和选用40 nm金纳米粒子为基底的SARS-CoV-2低浓度S蛋白SERS光谱。结果表明,以40 nm金纳米粒子为基底,采用SERS技术检测SARS-CoV-2的S蛋白是完全可行的。SARS-CoV-2的S蛋白分子中的羧基与金纳米粒子发生了分子增强,氨基与金纳米粒子发生了电磁增强,从而使得SARS-CoV-2的S蛋白拉曼效应得到了增强,并使得峰位发生一定移动。实验获得了较好的SARS-CoV-2低浓度S蛋白SERS光谱,为建立敏感、特异、快速的SARS-CoV-2检测新技术提供了一种方法。     

Detection of total protein in milk using phosphomolybdic acid‐mediated surface‐enhanced Raman spectroscopy

Although many surface‐enhanced Raman scattering (SERS)‐based methods for detecting specific proteins have been studied, simple and direct detection of total protein in liquid using a SERS‐based method remains difficult. In this study, a distinguishable effect on the SERS spectra from pre‐mixture of phosphomolybdic acid (PMA) with protein was found, indicating that PMA could be used as a SERS reporter for total protein detection in a liquid sample. Further experiments confirmed a good linear relationship between a premixed concentration of protein (casein, whey protein or bovine serum albumin) and the SERS intensity of PMA in our SERS system. Using casein as a reference, a PMA‐mediated SERS method was proposed that can quantitatively analyze protein at 2.5–25 µg/ml with a limit of detection of 1.5 µg/ml. Our PMA‐mediated SERS method is a simple and rapid method for quantitative analysis of total protein in milk. Copyright © 2015 John Wiley & Sons, Ltd.     

Fluorescence Turn-On Analysis of Trace Protein Based on Carbon Nanodots and Hybridization Chain Reaction

In this work, an ultrasensitive method for trace protein detection based on fluorescent carbon nanodots and hybridization chain reaction (HCR) is designed. Generally, the synthesized bright carbon nanodots are conjugated with two hairpin-structured DNA probes, respectively, which act as subsequent HCR fuel strands. Since single-stranded parts of DNA probes could be easily absorbed on graphene oxide (GO) nanosheets, fluorescence emission of carbon nanodots is effectively quenched via fluorescence resonance energy transfer. However, in the presence of target protein, the aptamer sequence in another hairpin-structured DNA probe specially interacts with target and the hairpin is opened. A single-stranded region is thus exposed, which initiates HCR by coupling with the DNA fuel strands on carbon nanodots. The formed HCR product displays a rigid, long double-stranded structure, which facilitates the release of carbon nanodots from GO surface. As a result, fluorescence of carbon nanodots is recovered and initial concentration of target protein can be estimated. This protein detection method shows a favorable linear response with a low limit of detection (2.3 fg mL⁻¹). Furthermore, it is highly selective and capable of detecting target in biological fluids like serum samples, which demonstrates the promising applications of this method.     

基于高光谱成像的牧草粗蛋白含量检测研究

粗蛋白（CP）是评价牧草营养价值和品质参数的关键指标。快速、准确地对牧草中粗蛋白含量进行评估在畜牧业生产研究中具有重要意义。为确定牧草粗蛋白含量的高光谱特征波段及最优检测模型,研究分别于2017年5月至9月间在黑龙江省杜尔伯特自治区的人工牧草场（羊草）内每月随机选取35个样本,5个月共采集175个样本。采样时在样本点处放置1 m×1 m的样方,将样方内所有牧草全部齐地面收割采集后称重并冷藏保存。将样本带回实验室后,立即进行牧草叶片高光谱图像采集,同时采用凯氏定氮法对采集的牧草样本进行粗蛋白化学值测定,以此建立牧草粗蛋白含量高光谱数据集。研究首先通过Savitzky-Golay卷积平滑（SG）、多元散射校正（MSC）、变量标准化（SNV）、一阶导数（1-Der）和直接正交信号校正（DOSC）方法5种预处理方法对高光谱数据进行处理后分别建立偏最小二乘回归（PLSR）检测模型,从中确定最优预处理方法。利用最优预处理结果,分别采用连续投影算法（SPA）和随机蛙跳算法（RF）进行牧草粗蛋白含量的特征波段选择,并利用选择结果分别进一步建立PLSR模型,以此确定适合粗蛋白含量的特征波段选择方法,确定最优高光谱检测模型。结果表明,在五种高光谱预处理方法中,基于SNV方法预处理后所建立的高光谱PLSR模型表现最优（R2-P=0.929,RMSE-P=6.344 mg·g-1,RPD=4.204）。利用连续投影算法筛选的粗蛋白含量特征波长为30个,分布于530～700和940～1 000 nm范围内。经随机蛙跳算法确定的粗蛋白含量特征波段为6个,分别为826.544,827.285,828.766,971.012,972.494和973.235 nm。因此,该研究中牧草粗蛋白含量最优高光谱检测模型为SNV-RF-PLSR（R2-P=0.933,RMSE-P=6.034 mg·g-1,RPD=4.322）,模型精度较高。该研究结果为牧草粗蛋白含量的高光谱检测提供了最优模型和理论基础,同时为指导草业生产开拓了新的技术思路。     

基于亚微米光栅透射共振蛋白质检测模型研究

建立了一种基于亚微米光栅透射共振理论的蛋白质检测模型,设计了一种金属光栅型蛋白质检测生物传感器,运用光栅耦合激发表面等离子体共振理论对提出的模型进行了理论分析,通过计算机计算模拟,分析了蛋白质样品折射率、厚度等对透射率的影响。结果表明:透射率与样品折射率、厚度呈二阶多项式关系,并且厚度、折射率都随灵敏度的增加而增加。这种检测模型可应用在蛋白质检测传感方面。基于此方法的蛋白质检测模型具有同时检测蛋白质种类和含量、灵敏度高、实时、无需标记,便于集成芯片化,适用于批量生产、成本低等优点,在蛋白质芯片、生物分析、环境监测、生物器件研发等方面具有广泛的应用前景。     

Label-free high-throughput and real-time detections of protein interactions by oblique-incidence reflectivity difference method

Selected Mouse IgG of 1 mg/mL as target was fabricated on microarray for 500 sample dots.Label-free and real-time reaction dynamic processes were detected between the microarrays with Goat Anti-mouse IgG of 0.02 mg/mL using the obliqueincidence reflectivity difference(OIRD)method.We obtained the reaction results and the reaction dynamic curves of 500 protein dots.In addition,we also used label-free detection of protein microarrays of 10080 sample dots,including BSA and different concentrations of Mouse IgG and Rabbit IgG,by OIRD.The obtained reaction results between the protein microarray with 1 mg/mL Goat Anti-mouse IgG and 1 mg/mL Goat Anti-rabbit IgG are reported herein.Experimental results show that OIRD can be not only label-free high-throughput detection method for biological microarrays but also label-free real-time detection in the interaction processes of biomolecules.     

Detection and Analysis of Protein Aggregation with Confocal Single Molecule Fluorescence Spectroscopy

The misfolding and aggregation of proteins is a common phenomenon both in the cell, in in vitro protein refolding, and the corresponding biotechnological applications. Most importantly, it is involved in a wide range of diseases, including some of the most prevalent neurodegenerative disorders. However, the range of methods available to analyze this highly heterogeneous process and the resulting aggregate structures has been very limited. Here we present an approach that uses confocal single molecule detection of FRET-labeled samples employing four detection channels to obtain information about diffusivity, anisotropy, fluorescence lifetimes and Förster transfer efficiencies from a single measurement. By combining these observables, this method allows the separation of subpopulations of folded and misfolded proteins in solution with high sensitivity and a differentiation of aggregates generated under different conditions. We demonstrate the versatility of the method with experiments on rhodanese, an aggregation-prone two-domain protein.     

Mechanics of binding of a single integration-host-factor protein to DNA

We report on a single-molecule experiment where we directly observe local bending of a 76 base pair DNA oligomer caused by specific binding of a single integration-host-factor (IHF) protein. The conformational change of the DNA is detected by optically monitoring the displacement of a micron size bead tethered to a surface by the DNA. Since in the bound state the DNA loops around the IHF, a mechanical tension on the DNA tends to eject the protein. We measure how the rate for the protein to fall off the DNA depends on the mechanical tension in the DNA, gaining insight into the energy landscape for this molecular bond. Our method further demonstrates a new paradigm of molecular detection, where ligand binding is detected through the conformational change induced in the probe molecule. Here this allows the detection of single, unlabeled proteins.     

用铀试剂I共振光散射法测定蛋白质的研究

本文提出一种新的光散射探针染料———铀试剂Ⅰ (ArsenazoⅠ ) ,在pH 3 2 9的条件下 ,ArsenazoⅠ本身只有极弱的光散射 ,它与蛋白质的结合物有强烈的共振光散射作用。在λ =4 0 0nm处 ,光散射有最大强度 ,光散射强度与蛋白质的浓度成正比。据此建立了一种测定蛋白质的新方法。该方法简便、快速、灵敏度高 ,对HSA的检测限达到 6 0ng·mL-1 ,线性范围达到 0～ 18μg·mL-1 ,用于人体血清样品的分析并同考马斯亮蓝法比较 ,取得了令人满意的结果。本文也研究了牛血清白蛋白 (BSA)、γ球蛋白、鸡蛋白蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶与染料ArsonazoⅠ之间的作用 ,探讨了共振光散射的机理     

Microwave-Triggered Metal-Enhanced Chemiluminescence (MT-MEC): Application to Ultra-fast and Ultra-sensitive Clinical Assays

In this rapid communication we describe a new approach to protein detection with chemiluminescence. By combining common practices in protein detection with chemiluminescence, microwave technology, and metal-enhanced chemiluminescence, we show that we can use low power microwaves to substantially increase enzymatic chemiluminescent reaction rates on metal substrates. As a result, we have found that we can in essence trigger chemiluminescence with low power microwave (Mw) pulses and ultimately, perform on-demand protein detection assays. Using microwave triggered metal-enhanced chemiluminescence (MT-MEC), we not only improve the sensitivity of immunoassays with enhanced signal-to-noise ratios, but we also show that we can accurately quantify protein concentrations by integrating the photon flux for discrete time intervals.     

依来铬青R-蛋白质体系的共振光散射特征及微量蛋白质的光散射法测定

基于蛋白质对有机染料依来铬青R共振光散射的增强作用 ,拟定了一种测定蛋白质的共振光散射法。在pH 4 0的酸性介质中 ,依来铬青R在 4 0 0nm处的共振光散射增强与蛋白质浓度呈线性关系 ,对牛血清白蛋白 ,测定的线性范围为 0～ 5 0mg·L-1 ,检测限 4 4 4 μg·L-1 。该方法简便 ,快速 ,灵敏 ,稳定性及选择性好 ,用于人尿样品中蛋白质含量的测定 ,结果满意     

多目标探测的摆镜动态角位置测量方法

为进一步提高CCD图像测角的摆角测量精度,提出一种基于多目标探测的摆镜动态角度测量方法。该方法采用多条等宽的平行狭缝作为CCD探测目标,首先利用灰度质心算法得到各狭缝的质心位置,进而将各狭缝的质心位置进行平均运算,得到摆镜的动态角位置。模型表明当使用m条等宽狭缝目标进行测量时,其动态测量误差方差为单目标方法的1／m。实验结果证明,该方法可以有效地提高摆镜动态角位置测量精度。     

Immunosensor application based on Raman spectroscopy of porous silicon

Porous silicon (PS) suitable for optical detection of immunoreaction is fabricated. The structure of immunosensor is prepared by the following steps: oxidization, silanization, glutaraldehyde cross-linker, and covalent binding of antibody. When antigen is added into the immunosensor, the Raman intensity is estimated to be linearly reduced according to the concentration of the surface protective antigen protein A (spaA) of below 4.0 μg ml-1. The ultimate detection limit is 1.412 × 102 pg ml-1. Controlled experiments are also presented with non-immune antigen of the spaA, and results show that the immunosensor has high specificity. Compared with the conventional enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA), this method is quick, inexpensive, and label-free.     

基于高光谱的牛奶中真蛋白质含量反演

牛奶蛋白质的分析和监测是奶制品行业中不可或缺的环节利用可见光/近红外反射光谱(350～2 500 nm)进行纯牛奶中真蛋白质含量的快速定量反演。分别通过ASD地物光谱仪和CEM真蛋白质测定仪采集牛奶样本的反射光谱数据以及蛋白质含量数据,对比分析不同的光谱预处理方法和波段筛选方法,得到特征波段,最后利用主成分回归(PCR)和最小二乘支持向量机(LS-SVM)模型建立牛奶反射光谱和蛋白质含量之间的定量校正模型,并对其预测能力进行比较,从而确定最优的牛奶中真蛋白质含量反演模型。实验结果证明：(1)比较不同光谱预处理方法,发现多元散射校正与二阶微分联合使用效果较好;(2)相对于全光谱建模,适当的特征变量优选有助于提高建模精度,缩短建模时间;(3)PCR的验证集决定系数R2_P为0.952 2,验证集均方根误差RMSEP为0.048 7,而LS-SVM的R2_P为0.958 0,RMSEP为0.048 2,其预测精度要优于PCR。研究表明,可见光/近红外高光谱反射率数据可以为牛奶真蛋白质含量的检测提供一种快速、无损的新方法。     

光寻址电位传感器的正交相位检波检测方法

光寻址电位传感器的幅度检测方法易受噪声干扰,灵敏度差,信噪比和精度低,且受调制光源的影响较大,影响检测结果的准确性.为此提出了一种基于正交相位检波的光寻址电位传感器检测方法.该方法是将光寻址电位传感器的输出光电流信号分别与两路正交信号相乘,通过低通滤波提取直流分量并相除,即可得到光寻址电位传感器的输出信号相位信息.与已有的光寻址电位传感器相位检测方法相比,该方法具有算法复杂度低、实时性高的优点.实验研究了调制光源光强对光寻址电位传感器幅度检测和相位检测的影响,对比分析了光寻址电位传感器的传统幅度检测方法与正交相位检波检测方法对pH检测的灵敏度、线性度及信噪比.结果表明,相比于幅度检测方法,调制光源光强对光寻址电位传感器的相位检测影响更小,在频率为10 kHz,pH的范围为1.68~10.01的情况下,相位检测方法比幅度检测方法测得的灵敏度增加了7 mV/pH,精度提高了14.9 mpH,非线性误差减小了0.003%,均方差减少了0.1051×10^-5,信噪比增加了8.2827 dB.该方法特别适用于弱光下的光寻址电位传感器检测.     

基于顺序注射分析的海水亚硝酸盐快速检测方法研究

为实现海水亚硝酸盐的快速检测,使测量过程更适用于在线监测,对前期已有的顺序注射分析技术进行了优化,结合自主研制的Z型高灵敏度液芯波导样品池和多适应环管器,基于分光光度检测方法,在不完全显色反应的基础上,建立了一种海水亚硝酸盐快速全自动检测方法。进样技术中高精度注射泵与多通道选择阀配合,顺序吸入样品和试剂至储液盘管后,再反推至混合盘管,期间发生不完全显色反应,并最终由注射泵将显色混合溶液缓推过Z型液芯波导样品池,同步流动检测溶液吸光度变化,结合朗伯比尔定律最终获取待测亚硝酸盐溶液浓度。为达到稳定且快速分析的目的,分析了测量方法中几个关键参数,如不完全显色反应时间、检测时流速和盐度对测量结果的影响,寻求最佳的技术及参数组合。不完全显色反应研究结果表明,在10~60 s显色时间范围内,吸光度检测结果的相对标准误差（RSD）均不超过1.64%,说明10~60 s的显色时间对本方法无影响,因此选择10s作为快速检测方法的显色反应时间。通过对不同流速情况下样品检测结果的分析发现,流速过快会导致检测不稳定,过慢则不利于快速分析,选择吸光度测量较为稳定的10,11.6,13和15 μL·s-1四个流速,对测量结果的稳定性和重复性进行分析,结果表明,上述四个流速下的线性效果都很好,因此,选择最快的15 μL·s-1作为该方法的检测流速。为验证该方法对盐度的敏感性,以适应淡水和大范围海水为出发点,研究分析了0~35盐度范围内,三种不同浓度（150,250,350 μg·L-1）亚硝酸盐溶液的吸光度变化情况,得到的RSD分别为1.39%,2.03%和1.28%,证明盐度对本方法的吸光度测量基本无影响。对80,150和250 μg·L-1亚硝酸盐标准溶液平行测定11次得到的RSD分别为2.13%,1.07%和1.83%,说明本方法精密度较好。通过对空白样品进行10次平行样测量,计算得到本方法检出限为37 μg·L-1（约0.5 μmol·L-1）。为验证本方法的可信度,利用该快速检测方法和《海洋调查规范》标准测量方法对同一批次亚硝酸盐标准溶液制作标准曲线,二者的R2均大于0.999,对同一浓度样品两种方法得到的测量结果数据拟合线性回归方程为y=1.046 1x-0.005 7,R2=0.999 6,说明两种检测方法结果高度一致,更进一步验证了该研究快速测量方法的可行性和可靠性。亚硝酸盐快速检测方法测样速率高达50样·h-1,与传统的人工检测和流动注射分析方法相比,亚硝酸盐的测量耗时从十几分钟缩短到1 min左右,检测分析过程中样品和试剂消耗量极少,测量过程重复性好,整个测量过程全自动进行,操作更为简单智能,避免了人工介入带来的误差,使得基于分光光度的营养盐要素在线及原位检测系统更加小巧、快速和低耗,更适用于现场在线及长时间序列监测,具有很广的应用范围和较好的应用前景。     

Box-Behnken法冷鲜滩羊肉蛋白质的高光谱模型优化

高光谱成像技术是一种将成像与光谱相结合的新型无损检测技术,属于间接分析方法;光谱模型的建立非常关键,需综合考察各建模因素间的交互作用。应用Box-Behnken法设计响应面试验优化冷鲜滩羊肉蛋白质含量的可见/近红外高光谱定量检测模型。使用可见/近红外高光谱成像系统采集冷鲜滩羊肉样本的高光谱图像,分析肉样反射光谱特性。采用二维相关光谱技术（2DCOS）,以冷鲜滩羊肉中蛋白质含量为“外界扰动”,研究扰动条件下光谱信号的动态变化,解析二维相关光谱谱图特征,寻找与微扰相关的敏感变量。分别采用多元散射校正（multiplicative scatter correction,MSC）和标准正态变量变换（standard normalized variate,SNV）提取有用信号,优化所选特征波段光谱质量。为实现数据快速降维,减少大量光谱数据处理负担,采用变量组合集群分析法（variable combination population analysis,VCPA）和应用竞争性自适应加权算法（competitive adaptive reweighted sampling,CARS）对2DCOS范围内特征波段进行二次优选。根据Design-Expert软件中Box-Behnken法设计响应面试验,以特征优选、光谱预处理及多元校正方法为考察因素,各因素中3种不同方法为水平,建立冷鲜滩羊肉蛋白质含量分析的优化检测体系。结果表明,波长473,679,734和814 nm处存在较强的自相关峰,473~814 nm范围内的特征波段为冷鲜滩羊肉蛋白质检测的敏感区域;MSC和SNV能够消除肉样自身散射作用的干扰,CARS和VCPA对特征波段进行二次优选,分别优选出了16和9个特征波长;各因素对蛋白质可见/近红外光谱模型预测性能的影响顺序为特征优选方法>预处理方法>多元校正方法,优选出2DCOS-SNV-LSSVM模型具有较高的运行速率和预测能力,其R_c=0.858 8,RMSEC=0.005 8;R_p=0.860 4,RMSEP=0.005 7。研究表明,Box-Behnken法在可见/近红外高光谱（400~1 000 nm）建模参数优化选择中的应用,可以有效地实现滩羊肉品质智能监控与质量安全快速无损分析,为分析对象光谱模型的优化及提高预测结果的准确性提供理论参考。     

Duffing振子微弱信号检测方法研究

在前期实验工作的基础上,从理论分析的角度,提出了利用Duffing振子从大周期态向混沌态的相变 作为判据的微弱周期信号检测方法,给出了检测原理,并论证了其可行性;从过渡带影响和检测概率两方面 将该方法与传统的检测方法进行了比较分析,并对两者的检测性能进行了仿真对比.分析和仿真结果都显示,相同条件下, Duffing振子从大周期态向混沌态的相变受过渡带影响更小,所提方法具有更好的检测性能. 实验数据还表明, Duffing振子检测微弱信号只能基于单向相变, 利用阵发混沌进行频差检测只适用于待测信号信噪比较高的情况. 关键词： Duffing 混沌 检测 过渡带     

基于面阵CCD的瞬态光谱检测方法研究

针对瞬态光谱检测中对CCD线扫描速度要求高的特点,提出一种基于面阵CCD的瞬态光谱检测方法。该方法通过改变面阵CCD的电荷转移方式,以实现基于面阵CCD的高速线扫描。为了探究此方法的可行性,初步通过改变线阵CCD的电荷转移方式,建立了基于线阵CCD的单点超快探测系统。在发光二极管(light emitting diode,LED)光脉冲探测实验中,系统分别工作在单点超快探测模式和正常模式下。测试结果表明,基于线阵CCD的单点超快探测方法是可行的,单点探测速率可达20MHz。从而在理论上证明,通过改变CCD电荷转移方式以实现基于面阵CCD的瞬态光谱检测也是切实可行的。     

氯酚红-蛋白体系的共振光散射法定量测定蛋白质

研究了酸性染料氯酚红与蛋白质的结合反应。在pH为4.00的邻苯二甲酸氢钾缓冲介质中,氯酚红与蛋白质通过分子间作用力形成复合物。使最大波长约为340nm的共振光散射光谱得到加强。基于这一现象可以测定低至0.020mg·L~(-1)的血清白蛋白,工作曲线在0～0.75mg·L~(-1)范围内呈线性关系。此方法的稳定性好,灵敏度高,用于人血清试样中总蛋白的测定,与常用的双缩脲法基本一致,且灵敏度高。