Saxiptlilin蛋白分离纯化及其活性测定

Saxiphilin是一种能与麻痹性贝类毒素(PSPs)特异性结合的可溶性血清蛋白,利用超滤离心及凝胶层析从牛蛙血浆中分离纯化Saxiphilin活性蛋白使其达到一定纯度,通过酶联免疫检测技术对其活性进行研究.结果表明:分离纯化目标蛋白时,采用pH值为6.5的Tris-HCl缓冲液,使用超滤离心、凝胶层析时目标蛋白的纯化倍数分别为5.9和11.2,回收率为67.8%和50%.通过SDS-聚丙酰胺凝胶电泳验证其分子量为90kDa,并通过毒素粗蛋白的结合曲线可得粗蛋白与PSP浓度比达到46.86时,目标蛋白结合PSP毒素的量达到饱和.将Saxiphilin蛋白应用于微量滴定板来检测PSPs,具有快速、简便、灵敏、特异、经济等优点.     

影响海洋微藻生产麻痹性贝类毒素的重要生态因素

麻痹性贝类毒素是有害赤潮海洋微藻生产的重要毒素种类，本文综述了影响该类毒素的主要生态因素有光，温度，盐度和营养盐4类；弱光对毒素合成有抑制作用。低温下PSP毒素产量高，通过对营养盐吸收机制的离子效应，盐度可影响毒素的生命合成，不同种类和株系对N、P限制的反应有极大差异。     

黑虎虾Crustin的克隆表达纯化及抑菌活性测定

从黑虎虾血淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码Crustin成熟肽的cDNA序列,将其克隆至pMD18-T载体进行扩增,然后克隆到pET-32a(+)表达载体中,转化至E.coliOrigamiTM(DE3)中表达Crustin抗菌蛋白,后通过Ni2+亲和层析柱纯化获得Crustin蛋白,采用滤纸片扩散法检测该蛋白的抑菌活性     

Taura 综合征病毒主要结构蛋白的表达与纯化

根据Taura综合征病毒(TSV)基因组,设计特异性引物,从感染病毒组织中提取组织总RNA后扩增,分别将3个主要结构蛋白基因VP1、VP2和VP3克隆到pGEM TEasyVector.与表达载体连接后,导入大肠杆菌中诱导表达,并纯化目的蛋白.诱导表达的融合蛋白分子量分别为54.2×103、43×103和57.1×103,在变性条件下过柱纯化VP1和VP2,一次可以纯化10mg以上纯度较高的蛋白.     

沼泽绿牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性检测

以沼泽绿牛蛙皮肤分泌液为样品,采用C18反相柱液相色谱,使用线性梯度洗脱方法,参照获得的RP-HPLC图谱,对图谱结果分析,按每峰一管收集洗脱液,得到分离纯化的活性多肽.用纸片法测定每管的抗菌活性,对抗菌活性最强的洗脱液进行氨基酸序列测定,查询数据库并进行序列比对,发现与牛蛙抗菌肽RANATUERIN2 、RANATUERIN3有序列相似性,推断其可能是沼泽绿牛蛙皮肤分泌液中的抗菌肽.     

昆虫细胞凋亡蛋白酶caspase-1的表达纯化及活性分析

依赖于天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶(caspase)在细胞凋亡途径中起着不可替代的关键酶作用.本研究采用原核表达载体pET32a表达和纯化了家蚕细胞Bm-caspase-1及粉纹夜蛾细胞Tni-caspase-1蛋白酶,序列分析表明二者具有相同的内部剪切识别序列,且酶活性位点均为QACQ↓G.纯化获得大量可溶性蛋白酶,Western-blotting分析表明Bm-caspase-1在大肠杆菌中已自我剪切活化,而Tni-caspase-1没有自我剪切,无酶活性;活性Bm-caspase-1蛋白酶对caspase-3特异性底物Ac-DEVD-AMC的降解酶活性可被Z-VAD-FMK呈剂量依赖性抑制,半抑制浓度约20nmol/L.此外,活性Bm-caspase-1蛋白酶能够转活化无活性的Tni-caspase-1蛋白酶原.结果揭示了昆虫细胞caspase同样具有与哺乳动物细胞caspase相似的底物降解活性并可相互剪切激活,为进一步研究昆虫细胞凋亡的分子途径奠定了基础.     

葛根总黄酮的分离与纯化

通过静态和动态吸附与脱附的比较,从5种国产大孔树脂中优选了AB-8型大孔树脂对微波辅助萃取的葛根总黄酮粗液进一步分离纯化研究.考察了进液浓度、进液量、进液流速和pH值对吸附的影响,确定了它们的适宜工艺条件分别为6.693 1 mg·mL-1、3 BV、1.0 mL·min-1和pH 7.考察了洗脱液乙醇浓度、洗脱液流速和洗脱液量对脱附的影响,确定了它们的适宜工艺条件分别为70%、1.0 mL·min-1和5 BV.在适宜工艺条件下分离纯化后的葛根总黄酮产品纯度可达70%.建立了Langmuir等温吸附方程,该模型与实验值吻合较好.实验还进行了脱附葛根素的研究,结果表明,用浓度为10%的乙醇水溶液脱附的葛根素浓度可高达40%.     

槲寄生蛋白注射液细胞毒活性测定的MTT方法探讨

采用MTT比色法对体外培养的肿瘤细胞进行细胞毒作用实验，验证槲寄生蛋白注射液体外抗肿瘤效果．并且鉴定这种检测方法的有效性。实验结果表明槲寄生蛋白注射液有一定的体外抗肿瘤效果；MTT比色法是一种可用的体外细胞毒作用检测法，为新药品的开发提供了实验依据。     

池蝶蚌金属硫蛋白基因的原核表达及活性分析

筛选池蝶蚌性腺转录组并运用RT-PCR方法扩增池蝶蚌金属硫蛋白(metallothionein,MT)ORF框序列。该序列有216个碱基组成,编码71个氨基酸,其中半胱氨酸含量丰富,富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys结构。多序列比对表明,池蝶蚌MT蛋白序列和其他物种MT序列有很高的同源性,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)MT蛋白具有100%的同源性。将该ORF框片段导入原核表达载体pET-32a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为27kDa,在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导4h表达量最高,重组蛋白主要存在上清液中,纯化并获得了重组蛋白。细胞增殖实验表明,纯化的MT融合蛋白有生物活性并能有效地减轻宫颈癌Hela细胞的氧化胁迫效应。     

掌叶半夏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其性质

经硫酸铵分级沉淀、热处理、DEAE等方法从掌叶半夏中分离出一种不含糖的具有抗虫作用的胰蛋白酶抑制剂(Pinellia pedatisecta trypsin in hibitor,PPTI),SDS-PAGE电泳与反相液相色谱(RT-HPLC)检测证明分离得到一纯蛋白,质谱(LC-MS)测定其相对分子质量为20596.09.荧光光谱分析研究结果显示:PPTI在pH低于9、温度低于60℃时,PPTI的三级结构相对稳定;抗虫活性结果显示有较好的抗芽虫作用.     

HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯

应用PCR方法扩增出人丙型肝炎病毒全长NS4基因的DNA片段,克隆入表达载体pQE32并转化E.coliJM109.经IPTG诱导表达出42×l03蛋白.利用Ni-NTA-agarose纯化得到纯化产物,Western-blot鉴定该蛋白能够与抗NS4的单克隆抗体发生特异性反应.     

水稻叶片Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶的纯化和活性测定

通过高速离心、(NH4)2SO4沉淀、琼脂糖凝胶过滤和CaM-sepharose4B亲和层析,从HPGMR(58S)叶片中初步纯化出Ca^2 ／CaM依赖性蛋白激酶．纯化的Ca^2 ／CaM依赖性蛋白激酶经SDS-聚丙烯酰胺凝胶线性梯度电泳,亚基分子量约为55X10^3在Ca抖／CaM依赖性蛋白激酶的标准反应体系中,存在过量的ATP,提取磷酸化反应剩余的ATP,用叶绿体Mg^2 -ATP酶分解ATP,最后用复合孔雀绿测定无机磷,从而来计算ca^2 ／CaM依赖性蛋白激酶的活性．实验结果表明,该酶活性是依赖Ca^2 和CaM的,并且EGTA和TFP对酶活性有明显的抑制作用．     

水稻叶片Ca~(2 )/CaM依赖性蛋白激酶的纯化和活性测定

通过高速离心、( NH4) 2 SO4沉淀、琼脂糖凝胶过滤和 Ca M- sepharose4B亲和层析 ,从 HPGMR( 5 8S)叶片中初步纯化出 Ca2 / Ca M依赖性蛋白激酶 .纯化的 Ca2 / Ca M依赖性蛋白激酶经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶线性梯度电泳 ,亚基分子量约为 5 5× 10 3.在 Ca2 / Ca M依赖性蛋白激酶的标准反应体系中 ,存在过量的 ATP,提取磷酸化反应剩余的 ATP,用叶绿体 Mg2 - ATP酶分解 ATP,最后用复合孔雀绿测定无机磷 ,从而来计算 Ca2 / Ca M依赖性蛋白激酶的活性 .实验结果表明 ,该酶活性是依赖 Ca2 和 Ca M的 ,并且 EGTA和 TFP对酶活性有明显的抑制作用     

重组可溶性人TRAIL抑制肿瘤细胞增殖

取健康人外周血得到总RNA，利用RT-PCR获取全长TRAILcDNA，以此为模板，在2对不同的引物下作PCR，得到不同长度的DNA片段，克隆到表达载体pET30a，得到重组质粒pET30a-TRAIL（114～281）和pET30a-TRAIL（120～281），转化E．coli BL21（DE3）pLySs表达并纯化了2种不同长度的可溶性蛋白，分别是TRAIL（114～281）（蛋白A），TRAIL（120～281）（蛋白B），经MTT（四甲基偶氮唑盐）实验表明蛋白B能在6h内抑制不同类型的肿瘤细胞增殖，但其活性明显弱于蛋白A。     

mtPDI外源基因表达体系的构建及耐热性

二硫键异构酶(PDI)是1种重要的蛋白折叠酶,它催化蛋白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性。为了研究嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(mtPDI)的功能,克隆了mtP-DI基因的ORF区,构建了融合基因原核表达载体pET-28a(+)-mtPDI。将质粒pET-28a     

检测抗冻蛋白生物学活性两种方法的比较

为了比较两种方法测定昆虫抗冻蛋白生物学活性的优劣,通过抗冻蛋白细菌低温保护实验测定菌液OD600和菌落计数两种方法同时研究洛氏脊漠甲抗冻蛋白对大肠杆菌的低温保护效果.实验表明发现这两种方法所得结果相近,相关系数r=0.82~1.0,相关性显著(p<0.05).菌落计数法的误差小于OD值法,适用于菌落数少的情况,OD值法适用于菌落密度大的情况,两种方法都可用于研究抗冻蛋白低温保护活性.