猪IL-18成熟蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性鉴定

以含猪IL-18全基因的重组质粒pGEM-IL-18为模板,PCR扩增猪IL-18成熟蛋白基因.将IL-18成熟蛋白片段定向插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-IL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白(His-IL-18),并进行融合蛋白的纯化、生物学活性鉴定.结果表明,SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为2.1×104的融合蛋白,westem blot证实His-IL-18能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应.重组猪IL-18经纯化后,能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应,在Marc-145细胞上抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性为2.50×103IU/mg,在PK-15细胞上抗猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的活性分别为2.00×103和2.24×103IU/mg.表明建立的表达系统能够表达重组猪IL-18,表达的重组猪IL-18具有一定的生物学活性.     

汉坦病毒嵌合基因G2S0.7与CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的:构建含有汉坦病毒M基因(编码糖蛋白G2)和部分S基因(编码核蛋白主要抗原区段)以及S基因的多个CTL表位的多种蕈组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究.方法:构建含目的基因的重组腺病毒载体,并在VeroE6细胞中进行表达,利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、微量细胞中和试验、T淋巴细胞增殖实验及CTL杀伤实验等方法检测免疫反应.结果:成功表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效诱导针对汉坦病毒NP及GP的体液免疫应答和细胞免疫应答;同时我们发现含有CTL表位的重组腺病毒比不含CTL表位的重组腺病毒可以诱导小鼠产生更为有效的细胞免疫反应.结论:构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力.     

ATRP法制备聚(甲基丙烯酸氨乙酯-co-甲基丙烯酸N,N-二乙基氨乙基酯)基因载体

为得到低毒、高效的聚阳离子基因载体,以甲基丙烯酸氨乙酯(AMA)和甲基丙烯酸N,N-二乙基氨乙基酯(DEAEMA)为单体,以2-溴代异丁酸乙酯(EBIB)为引发剂,通过原子转移自由基聚合(ATRP)制备了两种聚(甲基丙烯酸氨乙酯-co-甲基丙烯酸N,N-二乙基氨乙基酯)阳离子无规共聚物(P(AMA-co-DEAEMA),简称P).琼脂糖凝胶电泳实验结果表明聚合物P作为阳离子载体可以有效地络合DNA,通过粒径仪测定的复合物粒子的尺寸在400 ～ 600 nm之间.扫描电镜观察的P/DNA复合物形貌是分散均匀的球形颗粒.以25kDa PEI为阳性参照,利用MTT比色法考察了聚合物P对HEK293T细胞的毒性.结果表明,聚合物P的细胞毒性低于25 kDa PEI的细胞毒性.以25 kDa PEI和裸质粒DNA作为参照,我们进一步考察了聚合物P与DNA形成的复合物在HEK293T细胞中的转染效率.结果表明P/DNA复合物在HEK293T细胞中的转染效率远远高于裸质粒DNA的转染效率,并且接近于25 kDa PEI/DNA复合物的转染效率.     

重组质粒pIRES-EGFP-BCL 11B电转染幼稚T细胞的可视化研究

将BCL 11B基因插入pIRES-EGFP构建重组质粒真核表达载体pIRES-EGFP-BCL 11B,采用电转染法将重组质粒转入人幼稚T细胞,转染24 h后,用原子力显微镜(AFM)观察转染前后细胞的表面形态以及生物物理性质的变化.转染72 h后,用CCK-8试剂检测幼稚T细胞的增殖情况.分别对空转的幼稚T细胞组、空载体转染组(pIRES-EGFP naked plasmid)、重组载体转染组(pIRES-EGFP-BCL 11B recombinant vector)、无电转无质粒的幼稚T细胞组进行实验.结果表明,4组幼稚T细胞的体积、高度、半宽度、粗糙度、表面颗粒大小等参数发生了变化,细胞杨氏模量以及细胞硬度也呈现很大变化,CCK-8结果显示,重组质粒pIRES-EGFP-BCL 11B电转染人幼稚T细胞后影响细胞的增殖.     

IL-24重组载体的构建及其联合化疗药物对SKOV3细胞中TUBB3与ERCC-1基因表达的影响

通过基因重组技术将白介素24(IL-24)基因片段分别克隆成pc DNA3.0-OSP-1-IL-24和pc DNA3.0-IL-24载体,利用逆转录PCR(RT-PCR)测定2种载体的表达.将2种化疗药物紫杉醇(PTX)与顺铂(DDP)分别作用于正常SKOV3细胞及pc DNA3.0,pc DNA3.0-IL-24,pc DNA3.0-OSP-1和pc DNA3.0-OSP-1-IL-24稳定转染SKOV3细胞(卵巢癌细胞株),通过噻唑蓝(MTT)法检测化疗药物联合IL-24基因对细胞的杀伤效果及细胞的增殖能力,应用实时荧光定量PCR技术检测人β-微管蛋白3(TUBB3)与核苷酸切除修复交叉互补基因位1(ERCC1)基因在各组细胞中的表达.RT-PCR检测结果显示,通过基因重组技术克隆了pc DNA3.0-IL-24与pc DNA3.0-OSP-1-IL-24载体,IL-24基因能提高SKOV3细胞对化疗药物顺铂和紫杉醇的敏感性.其联合化疗药物对肿瘤药物的IC50值分别下降了10倍和6倍,TUBB3和ERCC1基因在IL-24基因转染的SKOV3细胞内的表达水平与在正常SKOV3细胞内相比,分别下降4倍和10倍多.上述结果表明,IL-24联合化疗药物可明显下调TUBB3与ERCC1基因的表达,该实验为临床治疗卵巢癌提供了重要的理论依据.     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

主客体组装构建环糊精修饰基因微载体的研究

合成了二茂铁接枝聚乙烯亚胺( PEI-Fc),利用二茂铁与β-环糊精的主客体嵌套作用制备了环糊精修饰聚乙烯亚胺,核磁测定结果显示,每条PEI-Fc链上通过主客体作用嵌套的CD平均为26个.这种基于弱相互作用力的β-环糊精修饰聚乙烯亚胺能有效诱导DNA分子的缔合,在N/P值达到3以上时,可形成表面为正电荷、粒径为150 ～ 250 nm的球形粒子.在含10％胎牛血清的DMEM体外细胞培养基中,由于培养基中的蛋白质能够在粒子表面发生静电吸附,PEI-Fc/CD/DNA基因微载体显示出良好的稳定性.HEK293细胞培养结果显示,以表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP为模型,以N/P值为10的PEI/DNA组装体作为对照,N/P值为3、5和10的PEI-Fc/CD/DNA组装体的转染效率均达到对照组的2～3倍,这种基于主客体组装构建的环糊精修饰基因微载体显著提高了基因转染效率.     

粘着斑激酶的原核表达、纯化及抗体的制备

粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是细胞质内单亚基非受体型酪氨酸激酶,通过各种信号途径参与调节细胞生长、发育、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移等过程.采用PCR方法,从Flag-FAK质粒中克隆编码FAK C端273个氨基酸的基因片段,构建FAK融合蛋白原核表达载体pET28a( )/FAK,进行原核表达与蛋白纯化,取纯化的FAK蛋白免疫小鼠,制备FAK抗血清.结果表明构建的表达FAK C端功能结构域的原核表达质粒pET28a( )/FAK,经过BL21(DE3)大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子质量约33 kDa的融合蛋白,并利用小鼠制备了多克隆抗体,EL ISA检测显示该抗体有较高效价.荧光免疫结果显示此多克隆抗体与FAK蛋白特异性结合,为进一步研究神经细胞中FAK的作用机制奠定了基础.     

污染水产去甲基化表观遗传毒性EGFP评价方法

pEGFP-C3质粒经过体外人工甲基化处理后,被转染进入HepG2细胞以构建重组细胞株．以5-AZA为阳性去甲基化毒物与重组细胞共培养,通过亚硫酸氢钠测序法定量检测EGFP基因启动子区甲基化状态,通过实时定量PCR检测EGFP基因表达,借助流式细胞术和荧光摄片定量检测共培养细胞的绿色荧光强度,在DNA甲基化、EGFP基因mRNA表达、GFP蛋白等多个层次研究5-AZA染毒处理与其去甲基化能力和荧光表达改变的响应关系．对天津污染水产的去甲基化能力进行了实际样品测试．结果表明,5-AZA与重组细胞的DNA甲基化、基因表达、蛋白产物变化之间存在显著关联,具有较低的检出浓度和良好的重复性．天津污染海域的水产去甲基化能力较强．本文初步建立了一种污染物去甲基化表观遗传毒性评价方法．     

电击法磁性纳米颗粒作为水稻转基因载体的研究

建立了以磁性纳米颗粒为载体,由电击法介导基因导入植物细胞的优化方法。制备了粒径小于10nm的磁性纳米颗粒,与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因融合制备基因载体,同时,制备水稻悬浮细胞,加入电极杯中,调节电击条件为:电压分别是800,1000和1200V,电容25μF,电阻200Ω,直径10mm,电击数次。利用倒置荧光显微镜观察转化后的悬浮细胞,可以明显看到绿色荧光蛋白在水稻细胞内表达。说明纳米颗粒基因载体在电击作用下能有效进入细胞,利用磁性纳米颗粒作为基因载体电击法转化植物细胞初步成功。     

TNFa在血管内皮细胞ECV304中的靶向表达研究

在缺失了3'LTR U3区内病毒的启动子／增强子序列的逆转录病毒载体pLXSNd中,用血管内皮生长因子受体KDR的特异性启动子调控了TNFa在血管内细胞ECV304中的靶向表达。将构建的载体pLXSN-TNFa,pLXSNd-KDRp-TNFa和空载体pLXSN用PA317细胞包装后获得重组病毒,并用重组病毒分别感染NIH3T3细胞和ECV304细胞,培养物上清的ELISA结果证明,KDR启动子指导的TNFa在KDR阳性细胞ECV304中的表达量为在KDR阴性细胞NIH3T3中的表达量的8倍;而TR指导的TNFa在这两种细胞中的表达无明显差异,实现了TNFa在血管内皮细胞中的靶向表达,这可能为肿瘤基因治疗提供新途径。     

在昆虫细胞中克隆与表达人白细胞介素6

本文利用DNA合成及PCR技术对人白细胞介素6(hIL-6)cDNA进行转译优化与扩增,并同杆状病毒载体pVL 1393重组构建了pVL·IL-6载体;通过磷酸钙共沉淀法将pVL·IL-6 DNA与野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(wtAcMNPV)DNA共转染昆虫细胞Sf9,筛选出表达人IL-6的重组病毒rAc·IL-6,经ELISA定量测定rhIL-6表达水平约为1μg/ml;rhIL-6生物活性经IL-6依赖细胞系7TD1测定为10~6u/ml。     

SMS高表达对细胞内和培养基中SM水平的影响

为了研究神经鞘磷脂合成酶(SMS)活性与神经鞘磷脂(SM)代谢之间的关系,用SMS的同功酶(SMS1和SMS2)的表达载体(pCMV. sport 6- SMS1和pcDNA3.1-SMS2), 瞬时转染HEK293细胞, 通过薄层层析法测定神经鞘磷脂合成酶活性来检测SMS的表达水平, 同时测定细胞和培养基中的SM浓度. 结果显示, 用pCMV. sport 6-SMS1转染细胞后与对照组相比, SMS表达水平提高65%, 细胞内和培养基中的SM水平显著性升高(58%和46%, p＜0.01); 转染pCDNA3.1-SMS2后与对照组相比, SMS表达水平提高13%, 细胞内和培养基中的SM水平显著性升高(33%和 29%, p＜0.05). 实验结果表明, SM水平可被SMS1和SMS2调节. 由于SM是冠心病和动脉粥样硬化的独立危险因子, 因此本文研究结果有可能为冠心病和动脉粥样硬化的治疗提供新的靶点.     

重组HEV衣壳蛋白截短体的表达及鉴定

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)感染引起的肠道病毒性传染病. HEV是一种无囊膜的单股正链RNA病毒, 其编码区由3个开放阅读框(ORF)组成, 属戊型肝炎病毒科. HEV衣壳蛋白由ORF2编码. 本研究根据编码HEV ORF2 aa382~aa674的核苷酸序列克隆了p293基因, 并将其克隆入原核表达载体pET28a, 利用大肠杆菌BL21(DE3)对HEV衣壳蛋白截短体(p293)进行了表达. SDS-PAGE和Western blot检测结果表明, 在优化的表达条件下(1 mmol/L IPTG, 250 r/min, 37℃, 5 h), 重组蛋白p293能够在大肠杆菌内有效表达, 目的蛋白约占总蛋白的66.15%. TEM检测结果显示, 原核表达的p293能够在体外形成约30~40 nm的病毒样颗粒. 免疫印迹和免疫荧光检测结果表明, p293与HEV标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性. 实验结果表明, p293可应用于HEV宿主吸附和病毒装配研究, 为HEV的预防与诊断研究奠定了基础.     

口蹄疫病毒3ABC基因截短体在毕赤酵母中的表达及鉴定

将长为525 bp的口蹄疫病毒3ABC基因截短体克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中, 构建了重组表达质粒pPIC9K-3ABCt. 用BglⅡ线性化后, 电转化毕赤酵母菌GS115, 经表型筛选, PCR鉴定, 获得阳性重组菌(GS115/pPIC9K-3ABCt). 然后进行诱导表达, 通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果表明, 重组菌株成功分泌表达了分子量为40000, 具有免疫反应活性, 且呈二聚体形式的目的蛋白. 在96 h时表达量达到最高峰, 占分泌总蛋白的18%, 达到23.4 mg/L. 为进一步研制口蹄疫免疫和感染动物鉴别诊断试剂奠定了基础.     

酵母高稳定载体的构建及人-αA干扰素在酵母中的高表达和分泌

本文利用酿酒酵母天然2μm质粒的SnaBI位点与pEMBL Yi27质粒的SmaI位点经平末端连接,构建成酿酒酵母高稳定质粒载体pHC11,经测定表明,其酵母转化子在非选择培养条件下连续生长50世代后,仍有82％的细胞保留该质粒,此结果证实了2μm质粒中非功能区的存在,将人-αA干扰素基因表达分泌单元插入pHC11,构建成重组质粒转化酵母后,在完全培养基中发酵培养,经分析测定,培养上清液中表达产物占总蛋白量的36.8％,干扰素效价达2.6×10~(10)u/L,表明利用高稳定载体pHC11使人-αA干扰素在酵母中得到了高表达和分泌。     

10-羟基喜树碱的光谱性质、抗肿瘤活性及应用于细胞标记研究

通过紫外-可见光谱、荧光光谱和红外光谱等方法研究了药物10-羟基喜树碱(HCPT)的光谱性质.采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)法测定了HCPT对3种肿瘤细胞(HeLa,MCF-7和HT1080)的抗肿瘤活性,其IC50值分别为16.37,16.73和19.24μg/mL.测定了HCPT对正常细胞人胚肾细胞系HEK293T的生长抑制活性,最高抑制率达88.72%,表明正常细胞比3种肿瘤细胞对药物HCPT更敏感.以HeLa细胞为模型,利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒研究了HCPT的抗肿瘤作用机制,发现几乎所有细胞均同时被Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色,细胞膜为绿色,而细胞核为红色,表明HCPT诱导了HeLa细胞的晚期凋亡.通过荧光显微镜观察了HCPT在HeLa细胞中的分布,为其在细胞标记中的应用提供了科学依据.     

PEI-g-MPEG/白细胞介素-10基因传递系统转染背根神经节细胞的体外性能研究

探索非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物(PEI-g-MPEG)介导白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)体外转染原代培养背根神经节细胞(dorsal root ganglion cells,DRGs)的效果.采用本实验室设计合成的PEI-g-MPEG,与同时携带增强型绿色荧光蛋白报告基因及IL-10基因的真核表达质粒DNA(pDC316-EGFP/IL-10)形成复合物,以脂质体(lipofectamine)复合体系Lipo/pDNA为对照,通过溴乙啶(ethidiumbromide,EB)排斥实验、凝胶阻滞电泳实验、粒径与电位的测定及扫描电镜等实验方法观察PEI-g-MPEG/pDNA的复合效果.并且检测了复合物对DRGs的毒性、转染效果及IL-10的蛋白表达情况.结果表明,PEI-g-MPEG在N/P(PEI-g-MPEG所含的氮原子和质粒DNA中磷原子的摩尔比)为5时可完全复合pDNA;随着N/P的增大,PEI-g-MPEG/pDNA复合物的粒径逐渐减小,而表面电位逐渐增大;在N/P为15时报告基因转染效果和IL-10蛋白表达情况较好,复合物的形貌呈大小均一的球形.PEI-g-MPEG/IL-10基因传递系统对于神经病理性疼痛的基因治疗具有潜在应用价值.     

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用.方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因.通过重叠PER技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和Bgl Ⅱ双酶切后插入真核表达载体plRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FWB7-H3-Fc重组载体.脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定.该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白.通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响.结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌.结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用.     

普鲁兰多糖为骨架的新型阳离子非病毒基因载体

通过琥珀酸酐将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI, 分子量1000)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上, 合成了新型基因载体P-PEI. 利用 ¹H NMR、 FTIR、 粒度仪、 Zeta电位仪、 透射电镜和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒pDNA 的复合物进行了表征. 凝胶阻滞实验结果证明, 载体P-PEI在体外可以通过静电相互作用稳定结合pDNA, 并能有效抑制DNA水解酶及血清成分对pDNA的降解. 噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、 绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及荧光素酶表达质粒(pGL3)转染实验结果表明, 载体P-PEI在N/P高达12.5时对细胞MCF-7, HeLa和COS-7的毒性低于PEI; 当N/P 为6.25时能有效将pGFP和pGL3带入Hela 细胞并表达, 最佳转染效率及荧光素酶活分别为, 比Lipo 2000[(49.13±0.61)%, (58.47±7.62)×10⁸ RLU/mg蛋白) 略低. 因此以Pullulan为骨架材料的P-PEI是一种新的有潜在应用价值的非病毒基因载体.