大鼠颗粒细胞tPA和PAI-1表达的激素调控

本文研究了促性腺激素(FSH和LH)和促性腺激素释放激素(GnRH)类似物(GnRHa)对大鼠颗粒细胞(GC)tPA和PAI-1表达的调节。(1)FSH和LH及GnRHa或大蓟二萜醇-12-14烷基-13乙酸盐(PMA)可单独刺激GC分泌tPA;FSH(或LH)与GnRHa(或PMA)共同作用于GC时所增加的tPA活性比两者单独作用之和要高;(2)FSH和LH降低GC的PAI-1活性,而GnRHa和PMA则明显刺激GC的PAI-1活性和PAI-1 mRNA水平;(3)GnRHa和PMA刺激GC的PAI-1活性和PAI-1的mRNA水平;但在FSH或LH存在的情况下这种刺激受到完全抑制。因此促性腺激素和GnRHa对GC tPA和PAI-1表达的调控机制可能是不同的。     

hCG和GnRHa诱发去垂体大鼠排卵及卵巢PA活性变化的比较研究

促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)能诱导去垂体大鼠排卵,与hCG相比,所诱导出的排卵时间提前2-4h.GnRH拮抗物能完全阻断GnRHa和hCG不是作用在同一受体部位上.GnRHa也同hCG一样,只增加卵巢中组织型纤蛋白溶酶原激活因子(tPA)活性,而对尿激酶型PA(uPA)无明显影响.由hCG和GnRHa所诱导的卵巢tPA活性皆在排卵前达到高峰;GnRHa也能刺激卵丘-卵母细胞复合体中tPA活性;注射hCG明显增加血清孕酮水平,而GnRHa对血清孕酮含量没有明显影响.实验说明,GnRHa和hCG诱导排卵可能都是通过增加卵巢中tPA的活性这一共同途径而实现的.     

促性腺激素对幼鼠卵巢细胞PAI-1分泌的调节

本文研究结果表明:(1)组成滤泡壁主要成分的膜-间质细胞在排卵前分泌大量纤溶酶原激活因子抑制因子(PAI-1),作为屏障以阻止纤溶酶激活因子(tPA)分泌到滤泡外间质;(2)颗粒细胞只分泌微量PAI-1,却产生大量tPA。膜-间质细胞和颗粒细胞在分泌PAI-1的能力及在对激素反应的表达的动力学变化方面有明显不同;(3)只有成熟的卵丘-卵母细胞复合体才分泌大量PAI-1,因此,PAI-1有可能作为鉴定卵丘-卵母细胞成熟的一个可靠指标。     

小鼠Sertoli细胞tPA和PAI-1基因表达的激素调节

本文首次提出证据表明:(1)在FSH和cAMP生成因子作用下,小鼠Sertoli细胞主要分泌tPA,而Leydig细胞主要产生uPA;(2)Sertoli细胞也具有分泌PAI-1的功能。PAI-1基因表达明显受FSH、生长因子和GnRH激发;(3)因为在各种激素作用下Sertoli细胞分泌到培液中的tPA和PAI-1活性蛋白与细胞中的tPA和PAI-1mRNA增加一致,激素是在转录水平上调节小鼠Sertoli细胞tPA和PAl-1的生物合成。Sertoli细胞产生的tPA可能与精子发生有关。     

tPA Kringle-2结构域基因的合成及其在大肠杆菌中表达

本文用固相磷酸三酯法合成了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)174-262片段(Kringle-2结构域)对应的DNA序列。利用PIN Ⅲ OmpA2表达质粒的信号序列和Plpp-lac启动子在大肠杆菌中表达了tPA Kringle-2。约2/3的表达产物分泌在大肠杆菌的周间质中。经硫酸铵盐析,Lysine-Sepharose亲和层析和FPLC-MONOQ离子交换层析等3步纯化后其氨基酸组成和tPA 174-262片段的组成一致。放射结合分析证明重组表达的tPA Kringle-2具有纤维蛋白结合活性。     

人组织型纤溶酶原激活剂表达调控及高效表达的研究——Ⅰ.t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控

运用分子剪切技术构建了含不同长度3′端非翻译区(3′-UTR)的t-PAcDNA克隆,体外转录的mRNA在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达的结果表明t-PA mRNA 3′-UTR序列对其表达有明显抑制作用,3′-UTR缺失使t-PA表达水平提高3—8倍。进一步研究表明,t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的抑制是由3′末端长约200nt的富含AU序列所致。RNA稳定性试验证实这段富含AU的序列使t-PA mRNA稳定性下降3倍以上;将该序列插入荧光素酶(Luc)基因3′-UTR,使Luc的表达水平明显降低。分析了该序列调节t-PA表达的可能机理,提出了调控的模式。     

SARS病毒核衣壳蛋白的表达与鉴定

依据Genebank中SARS基因组序列和酵母菌对密码子的选择性,采用人工合成的方法,合成了优化的SARS病毒核衣壳蛋白(N)的全基因(1296bp),与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建成重组表达载体pPIC9K-N.重组载体转化毕赤酵母GS115,并经MD平板和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115-pPIC9K-N.用甲醇诱导其分泌表达目的蛋白并对表达产物进行分析、浓缩与鉴定.结果表明,SARS病毒核衣壳蛋白能实现在毕赤酵母中高效表达,表达量达到20%,初步纯化后的产物具有良好的抗原特异性.     

牛天然纤溶酶原Kringles结构域片段的获得及其抑制内皮细胞增殖作用研究

利用猪胰弹性蛋白酶和尿激酶限制性酶切牛纤溶酶原,获得了纤溶酶原Kringles结构域片段Kringles1-3(K1-3)和Kingles1-4(K1-4),研究发现,在没有自由巯基供体存在的条件下,尿激酶酶发牛纤溶酶原也能够产生K1－4,从而认为存在由尿激酶酶切牛纤溶酶原直接产生K1－4的途径,所获得的K1－3和K1－4对恒河猴脉络膜－视网膜RF／6A血管内皮细胞的增殖有抑制活性。     

新型抗HIV-1重组导向制剂SL41在毕赤酵母中的表达及活性实验

以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础, 通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A, SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41, 线性化后, 采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中, 经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子. 摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明, 目的蛋白得到良好表达, 表达量最高可达到47.9 mg/L. 目的蛋白经初步纯化后, 用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究, 结果显示, 目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应, 并可介导特异的CTL反应, 对靶细胞具有明显的杀伤活性, 表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂.     

原发肾病综合征患儿超声颈动脉参数、血清sTREM-1、suPAR水平变化及与急性肾损伤的相关性

选取原发性肾病综合征(PNS)患儿96例作为研究组,选取同期96例健康体检儿童作为对照组,开展前瞻性队列研究,均行超声颈动脉参数、血清可溶性髓系细胞表达的触发受体-1(sTREM-1)、可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(suPAR)水平检测,并进行对比分析。本研究发现,研究组患儿颈动脉内中膜厚度(cIMT)、平均管壁横截面积(WCSA)、血清sTREM-1和suPAR水平高于对照组,血管壁运动度(△D)低于对照组(P<0.05);PNS患儿TG、TC、尿NAG、β2-MG、24 h Upro与cIMT、WCSA、血清sTREM-1、suPAR水平间存在正相关关系,与△D间存在负相关关系(P<0.05);随着cIMT、WCSA、血清sTREM-1、suPAR水平升高及△D降低,PNS发病风险逐渐增加(P<0.05);cIMT、△D、WCSA、血清sTREM-1、suPAR联合预测PNS患儿急性肾损伤的曲线下面积(AUC)为0.914。据此可得PNS患儿超声颈动脉参数中cIMT、WCSA及血清sTREM-1、suPAR表达水平明显升高,△D异常降低,且均与患儿血脂升高、肾功能降低存在明显相关性,可辅助临床预测PNS患儿急性肾损伤风险。     

人肿瘤坏死因子(TNF)cDNA的分离、鉴定及其表达

PMA诱导的HL-60细胞株mRNA经逆转录合成cDNA;经过第一链cDNA为模板的PCR扩增反应,分离到一特异的615bp DNA片段。Southern杂交和DNA序列分析证实这一615bp片段包含了编码人TNF成熟肽所需的全部cDNA顺序。将这一人TNF cDNA克隆到大肠杆菌表达载体pKK223-3,获得人TNF直接表达质粒pHT-1。IPTG诱导的表达产物具有L-929细胞毒活性;并经抗体中和实验确证为人TNF。在A_(600)=2时,大肠杆菌产生的重组人TNF含量约为8×10~7U/1培养液。     

不相交主成分分析(PCA)和遗传算法(GA)用于差异表达基因的识别

建立了一种基于不相交主成分分析(Disjoint PCA)和遗传算法(GA)的特征变量选择方法, 并用于从基因表达谱(Gene expression profiles)数据中识别差异表达的基因. 在该方法中, 用不相交主成分分析评估基因组在区分两类不同样品时的区分能力; 用GA寻找区分能力最强的基因组; 所识别基因的偶然相关性用统计方法评估. 由于该方法考虑了基因间的协同作用更接近于基因的生物过程, 从而使所识别的基因具有更好的差异表达能力. 将该方法应用于肝细胞癌(HCC)样品的基因芯片数据分析, 结果表明, 所识别的基因具有较强的区分能力, 优于常用的基因芯片显著性分析(Significance analysis of microarrays, SAM)方法.     

口蹄疫病毒3ABC基因截短体在毕赤酵母中的表达及鉴定

将长为525 bp的口蹄疫病毒3ABC基因截短体克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中, 构建了重组表达质粒pPIC9K-3ABCt. 用BglⅡ线性化后, 电转化毕赤酵母菌GS115, 经表型筛选, PCR鉴定, 获得阳性重组菌(GS115/pPIC9K-3ABCt). 然后进行诱导表达, 通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果表明, 重组菌株成功分泌表达了分子量为40000, 具有免疫反应活性, 且呈二聚体形式的目的蛋白. 在96 h时表达量达到最高峰, 占分泌总蛋白的18%, 达到23.4 mg/L. 为进一步研制口蹄疫免疫和感染动物鉴别诊断试剂奠定了基础.     

带肝细胞受体结合区的HBV表面抗原蛋白性质的研究——preS区有不同缺失的表面抗原蛋白性质的比较

本文用聚合酶链反应(PCR)构建了四对preS区有缺失突变的乙型肝炎病毒表面抗原基因。对这些突变体及我们以前构建的缺失突变体在哺乳动物细胞中的表达和产物性质进行了比较,结果表明,preS区的部分缺失并不影响羧端S区的基本结构和氨端preS区的表面分布性。当缺失preS1区滞留顺序(a.a.2—19)后,preS区对S区带主要抗原决定簇的区域的掩蔽明显减弱。我们发现过长的preS区严重影响表面抗原蛋白从哺乳动物细胞中的分泌,除已知的滞留顺序外,preS1的另一区域(a.a.48—65)可能也有阻滞表面抗原蛋白分泌的作用,而preS2区对LS蛋白分泌的阻滞不起主要作用。preS1的肝细胞受体结合区(a.a.21—47)和S区直接融合所得蛋白性质稳定,分泌良好,有很强的抗preS1抗原性,是值得发展为新型疫苗的带preS1肝细胞受体结合区的表面抗原蛋白。     

N-二异丙基磷酰化氨基酸-N-4-氨基吡啶衍生物的合成及对河豚毒素(TTX)解毒生物活性的研究

通过母体化合物4-氨基吡啶(4-AP)与N-二异丙基磷酰化氨基酸(DiPP-AA)在Ph3P和C2Cl6体系下的缩合反应,将具有生物活性的氨基吡啶环引入到磷酸化氨基酸结构中,设计、合成了5个N-二异丙基磷酰化氨基酸-N-4-氨基吡啶衍生物A1～A5.所有目标化合物均经IR,1H NMR,13C NMR,31P NMR,MS的表征.初步生物活性测试结果表明:目标化合物对河豚毒素(TTX)中毒的小鼠均有一定的解毒作用,并不同程度地延长了生存时间,而且毒性比母体化合物降低了.     

苏芸金杆菌蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp. galleriae)(H5ab)δ-内毒素基因的克隆和表达

本文通过分子杂交得到阳性克隆FG2,带有8.5kb的Barn HI和Sal I插入片段,经western blot分析表明此重组子表达了130kD和68kD的δ-内毒素蛋白,能与HD-1的δ-内毒素抗血清反应,同时对2—3龄的玉米螟进行了生物活性测定,证明有毒杀活力。本工作首次报道了苏芸金杆菌蜡螟亚种(H5ab)的δ-内毒素基因在大肠杆菌中的克隆和表达,同时为δ-内毒素基因在130Md质粒上的定位提供了直接证据。     

一株红球菌脱硫菌株脱硫特性的研究

从炼油厂污水排放口取得的土样中筛选到一株能降解二苯并噻吩 (DBT)的菌株 ,用GC/MS方法 ,证明其降解DBT走硫专一脱除途径 ,即“4S途径” .该菌株被命名为SDUZAWQ ,用微生物生理生化实验及 16SrDNA序列分析初步鉴定为红球菌属 (Rhodococcussp .) .实验结果表明 ,红球菌SDUZAWQ可有效降解苯并噻吩 (BT)和DBT及其甲基衍生物 .在 2d内 ,BT与DBT可同时完全降解 ,0 .5mmol·L-1的BT在 1d内可降解掉 86% ,降解速度高于DBT的降解 .5 MBT的降解率也高于 4,6 DMDBT和 4 MDBT .4 MDBT较 4,6 DMDBT更难降解 ,在 2d内 ,红球菌SDUZAWQ可降解 62 %的 4,6 DMDBT ,而相同条件下 ,4 MDBT仅能被降解 3 6% .     

血管紧张素Ⅱ和DPDPE对NG108-15细胞c-fos的影响

本文应用免疫组化,免疫沉淀和点杂交方法研究了血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AⅡ)和δ阿片受体激动剂DPDPE对NG108-15细胞原癌基因c-fos表达的影响。结果表明,10~(-7)mol/L AⅡ可诱导NG108-15细胞c-fos的表达,显著增加Fos样免疫活性(FLI),Fos蛋白含量及c-fos mRNA的表达,这些作用能被特异性AⅡ受体拮抗剂Saralasin拮抗。10~(-7)mol/L DPDPE也能加速NG108-15细胞c-fos的表达,该效应可被阿片受体阻断剂纳洛酮阻断。在等摩尔浓度下,AⅡ的作用显著大于DPDPE。将AⅡ和DPDPE同时作用于细胞,c-fos被诱导表达的水平等于或反而低于AⅡ单独作用时的水平。以上结果首次报道,在神经母细胞和胶质细胞杂交株NG108-15细胞上,激活AⅡ和DPDPE受体均可诱导c-fos原癌基因的表达,而两者同时作用时则有相互抑制效应。     

铈对三角帆蚌钙代谢影响的研究

研究了不同浓度稀土Ce3+(0,0.5,1.0,2.5 mg·L-1)处理30,60 d时对2龄植片三角帆蚌钙代谢和珍珠质沉积的影响。结果表明:Ce3+对三角帆蚌珍珠质沉积量、外套膜和鳃组织中组织钙含量、钙调蛋白基因mRNA的表达量、腺苷三磷酸酶(ATPase)活性、碱性磷酸酶(ALP)活性的影响总体上均表现出明显的"低促高抑"的剂量效应和高浓度下"先促后抑"的时间效应。推测稀土Ce3+对钙调蛋白基因mRNA表达水平及关键酶活性的调节可能是其影响三角帆蚌钙代谢和珍珠质沉积的途径之一。     

地黄提取物改善贫血大鼠记忆及其机制

地黄滋阴补血填髓,广泛用于贫血和脑疾病患者,但其功效机制尚未阐明.本文探讨地黄水提物(Rehmannia glutinosa’s water extracts,RGWE)改善血虚大鼠记忆及其滋阴补血填髓的可能机制.采用断尾放血结合注射环磷酰胺制备贫血大鼠模型,随机分溶媒组和地黄水提物3,6,10g/kg治疗组,灌服等体积自来水或不同剂量地黄水提物10天,采用Morris水迷宫观测大鼠空间记忆能力,采用酶联免疫吸附测定方法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆红细胞生成素(EPO)水平,免疫组化和免疫蛋白印迹技术(Western blotting)检测分析脑EPO及其受体表达水平.成功制备血虚模型,表现为大鼠红细胞数和血红蛋白显著下降,与造模前比较差异显著(P<0.05),溶媒组空间记忆能力显著下降,地黄治疗组空间记忆能力明显提高,逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),一定时间内穿越平台次数显著增多(P<0.05);免疫组化和Western blotting结果显示脑组织EPO及其受体表达、血浆EPO水平均较溶媒组明显升高(P<0.05).地黄水提物显著提高贫血...