极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的基因克隆、表达和酶学性质的研究

极耐热酶在工业生产中有可观的潜在用途,为此从极端嗜热厌氧细菌海柄热袍菌中通过PCR方法克隆出Cel12B基因,构建重组表达质粒pET-20b-Cel12B,转化至大肠杆菌JM109（DE3）诱导表达后,获得极耐热重组内切葡聚糖酶．经过热处理和组氨酸亲和层析柱纯化,获得电泳纯单一条带,酶学性质测定表明：最适作用pH为6．0,最适作用温度90℃,在pH5．3～6.5之间酶活力稳定,90℃半衰期70min。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达及重组酶性质测定

将不含信号肽的瑞氏木霉内切葡聚糖酶II(Cel5A)的cDNA克隆到pET-28a(+)表达质粒上,与其N末端6个组氨酸标签序列融合,构建成pET-28a(+)-egl2表达质粒,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达.利用低温诱导策略,成功表达出活性重组蛋白.Western blot 结果显示重组Cel5A相对分子分量大约为43 000.进一步对重组Cel5A进行Ni-NTA亲和层析柱纯化并对其进行酶学性质测定,结果显示以羧甲基纤维素钠为作用底物时重组酶最适作用pH为4.5,最适作用温度为60℃;重组酶热稳定性较好,在65℃及以下保温1.5 h,活性仍相当稳定.Mn2+对Cel5A的酶活有促进作用,Fe3+和Cu2+有抑制作用,其它金属离子和EDTA对酶活没有明显影响.底物特异性研究表明,重组Cel5A只能水解混合键葡聚糖和羧甲基纤维素钠,对混合键葡聚糖的水解能力是其对羧甲基纤维素钠水解能力的6.7倍,但对微晶纤维素、Glass microfiber filters、木聚糖、阿拉伯木聚糖和木葡聚糖没有水解作用.     

内切葡聚糖酶的纯化及其基本性质

纤维素酶是自然界碳素循环中的一种关键酶,它可以将纤维素性材料,转化为可直接利用的葡萄糖,并可通过其它酶和酶系统的作用转化为乙醇及蛋白质。纤维素酶是多酶体系,包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(Cx)及β-葡萄糖苷酶。其中内切葡聚糖酶含有若干种同工酶,能将可溶性纤维素转化为还原寡糖,是纤维素酶系中的重要组分,为了深入研究Cx酶的性质,本文对其中一种Cx酶进行了分离纯化,并对其基本性质进行了研究。 1实验部分     

重组毕赤酵母产匍枝根霉内切葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及其酶学性质研究

将来源于匍枝根霉的endoglucanase Ⅱ(egⅡ)在毕赤酵母中实现异源表达,对构建完成的重组毕赤酵母进行高密度发酵,制备目标酶蛋白．发酵液经 Ni 柱分离纯化,得到分子量大小约为38 kDa,比酶活为37．8 IU/mg的蛋白．酶学性质研究表明：该酶最适反应温度为55℃,最适反应 pH 为4．8;Mn2＋、Zn2＋、Fe2＋对egⅡ的酶活力有一定的激活作用,Cu2＋对egⅡ酶活有抑制作用,Mg2＋、Co2＋、Na＋和K＋等离子对该酶的催化活力没有明显影响;该酶以CMC-Na为底物时其反应米氏常数为2．04 mg/ml．     

纺织用嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达、纯化与酶学性质

首先从Pyrococcus horikoshii中克隆出编码热稳定性的内切纤维素酶基因,以载体pet21a为表达质粒,构建重组质粒pet21a-1171,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys中进行表达,目的基因得到明显的可溶性表达,通过加热变性处理和离心后,重组酶纯度达到80%以上,随后对加热处理后的粗酶液进行简单酶活测定,结果表明,最适反应温度为95℃,与国外文献报道相一致,嗜热内切-1,4-β-葡聚糖酶成功得到重组可溶性表达。     

β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌菌株H9中,克隆到了编码葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,转化至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中进行表达,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.实验结果表明：该基因大小为1980bp,共编码659个氨基酸,在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;该酶的相对分子质量约为73000,由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成,其在不同温度和pH值下的活力和稳定性与原始菌株的比较接近.     

β-1,4-内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

运用选择性培养基LBCMC从环境土样中分离得到一株能利用羧甲基纤维素的芽孢杆菌Bacillus sp．NW-2004a，并运用“鸟枪”克隆法构建了其基因组文库，且从此基因组文库中筛选得到两个阳性克隆．对其中一阳性克隆中插入的DNA片段（命名为GLUD）进行序列测定，发现了一长度为2502bp的开放阅读框（ORF），可编码834个氨基酸．BLAST分析结果表明，该基因与Bacillus sp．KSM-S237来源的纤维素酶基因AB018420具86％相似性，所编码的多肽与Bacillus sp．KSM-64来源的β—1，4-内切葡聚糖酶具89％的相似性，故该基因是一新发现的β—1，4-内切葡聚糖酶基因．该序列已收录于Genebank，登录号AY663839．另外，以cpoI and NotI限制性内切酶双酶切衍生于质粒pGEX的大肠杆菌表达载体pHBM625，然后将经T4 DNA polymerase处理后的β-1，4-内切葡聚糖酶基因克隆至载体pHBM625中得到重组质粒pHBM625Glu，最后通过平板检测及SDS—PAGE凝胶电泳，均检测到该基因在大肠杆菌XL10-Glod中的表达．     

绿色木霉葡聚糖内切酶cDNA基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

用L-山梨糖诱导绿色木霉(Trichoderma viride)AS3.3711纤维素酶基因的转录,提取其总RNA反转录获得cDNA。PCR扩增葡聚糖内切酶(EG)和葡聚糖内切酶(EG)的cDNA基因,将其克隆到酵母载体中,构建产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。重组菌株能够识别EG和EG自身携带的信号肽而将表达产物分泌到胞外,故可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的重组转化子。重组菌株表达的EG酶活在诱导70h时达到最高(为0.08U/ml),表达的EG酶活在诱导60h时达到最高(为0.03U/ml)。     

枯草芽孢杆菌葡聚糖内切酶的克隆与表征

利用已公布的枯草芽孢杆菌基因组序列中假定的葡聚糖内切酶基因进行引物设计,从菌株Bacillus sp.ECU0013中克隆表达得到重组葡聚糖内切酶BsEG.经镍柱纯化后进行酶学性质表征,其最造反应pH约为6.0;最适反应温度为50℃,具有较好的热稳定性,50℃时半衰期达101h.Km值为20.1 g/L,相应的Vmax...     

极端嗜热厌氧纤维素分解菌基因文库的构建及其内切葡聚糖酶基因片段的克隆

以从云南邦拿掌温泉中分离、纯化的高温厌氧纤维素分解菌邦2菌(Cadicellulosiruptor)为材料,制备其总DNA,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ部分酶切后,在T4DNA连接酶的作用下与经EcoRⅠ完全酶切、去磷酸化的质粒载体pUC18连接,然后转化E.coliJM109,建立了邦2的基因文库,经筛选鉴定得到6.3×103个重组子;重组子经刚果红平板验证:约有23.5%菌落呈现透明圈;重组子经EcoRⅠ酶切验证显示:重组质粒均含有外源DNA插入片段.结果表明已克隆到邦2菌纤维素酶系中的内切葡聚糖酶基因(ED基因)片段.     

产苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

L-苯丙氨酸是人体8种必需氨基酸之一。酶法转化是目前生产L-苯丙氨酸的主要方法。为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量,对可高效表达苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM105进行培养,对发酵过程中pH值对工程菌生长的影响进行了研究。结果表明,摇瓶培养条件下,控制发酵过程中发酵液的pH值可显著提高菌体产量,当控制pH值为7.0左右时,菌体量比对照高87%。在初始pH值为7.5的情况下,培养10h后将培养液pH值分别调整为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,则以pH值为7.5时的菌体量最高。10L发酵罐中控制发酵液pH值为7.5,菌体密度可达A600=20mol/L（DCW=11g/L）,比不控制pH值高出33%。试验结果为进一步开展该工程菌的高密度培养提供了一定的参考。     

重组大肠杆菌发酵生产核酸疫苗的初步研究

初步摸索大肠杆菌DH 5α生产核酸疫苗的发酵条件。通过均匀试验设计确定,当胰蛋白胨与酵母粉的质量比为1∶1.2,并且磷酸盐的加量较大时菌体的质粒产量较高。在菌体生长刚进入对数生长期时采用指数式流加葡萄糖与采用恒速流加葡萄糖,菌体得率相同,而产物收率前者高于后者。在菌体生长进入平稳期时将温度由37°C升高到42°C,在菌体密度没有改变的情况下,质粒产量得到提高,达到75 m g/L。     

大肠杆菌中表达外源重组蛋白的研究

通过聚合酶链式反应（PCR）,扩增出交链孢菌激活蛋白辅助蛋白基因p42A．并将该基因按正确阅读框克隆到表达载体pGEx—KG中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游。重组质粒转化大肠杆菌BL21,通过建立重组菌生长时间与OD600值的关系,及对菌液密度、诱导剂浓度、诱导时间和温度等条件的摸索,根据SDS—PAGE电泳检测结果判断融合蛋白的最佳表达条件。实验结果表明,最适诱导时期为重组菌生长对数中期;IPTG的最佳浓度为1．0mmol／L：37℃下诱导培养4h时产物表达量最高。超声波破碎菌体细胞,离心及电泳结果表明,表达产物为可溶性蛋白。     

重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化

密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用pET-39b( )构建了融合表达载体,在大肠杆菌中进行了成功表达.37℃在含30 mg/L卡那霉素的LB培养基中培养,当细胞密度(D600)达到0.5时,降低温度到28℃,加入终浓度为0.1 mM的异丙基硫代-βD-硫代半乳糖苷诱导外源蛋白表达,继续培养6 h后收集菌体,融合蛋白(DsbA-sBEKLC)产量达到151.2mg/L,相当于80.6 mg/L sBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取sBEKLC,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8 mg sBEKLC,经检测sBEKLC具有生物活性.     

β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从一株短小芽孢杆菌H9克隆了编码葡聚糖内切酶的基因（该序列已经被已收录于GeneBank,登录号为EF620915）,序列分析表明该基因读码框为1980bp,编码659个氨基酸。预测的酶由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,第二个结构域为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成。将基因构建在大肠杆菌表达载体pET20b中得到重组质粒pET20b-EglA,将重组载体转化至大肠菌株BL21(DE3)菌株,基因在大肠杆菌中得到了良好的分泌表达, SDS-电泳图谱表明酶的分子大小约为73KD。     

IrrE重组大肠杆菌的构建和性能分析

利用p ET-28a(+)质粒将来源于耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)R1的irr E基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行异源表达,在IPTG终浓度2,mmol/L、诱导温度37,℃、诱导培养6,h条件下进行了蛋白诱导.进一步考察Irr E异源表达对大肠杆菌生长性能和耐受能力的影响,结果表明:Irr E的表达能够提高大肠杆菌正常条件下的生长速率和最终生物量;同时,能够不同程度提高大肠杆菌在压力冲击下的存活能力,其中,高渗条件下存活能力的提高最为明显.而重组菌株在压力冲击下的生长速率和最终生物量均明显高于对照菌株.这说明Irr E在提高大肠杆菌的压力耐受性方面表现出良好的效果.     

人超氧化物歧化酶-过氧化氢酶融合基因的构建、表达及其产物的初步纯化和性质研究

尝试应用基因工程技术制备一种兼具人超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性的双功能融合蛋白CAT-PTD-SOD,其中的PTD是序列为RKKRRQRRR的短肽.首先通过重叠PCR构筑CAT-PTD-SOD融合基因,然后把该基因转化进入大肠杆菌表达菌株Rosetta 2(DE3)菌株.通过SDS-PAGE、CAT和SOD活性分析以及分离纯化组分的分析确认该重组菌株能够表达CAT-PTD-SOD,其表达量可达总蛋白的8.9%,SDS-PAGE显示其分子量约为85 kD.可溶性实验发现该融合蛋白大部分以兼具SOD和CAT活性的可溶形式存在.抗H2O2能力实验表明CAT-PTD-SOD具有很好的抗H2O2能力,在0.033 mol.L-1、甚至0.067 mol.L-1的H2O2溶液中,其SOD活性20 min内无明显下降.     

重组大肠杆菌生产rhG-CSF发酵工艺的研究

在5L发酵罐中，研究了溶解氧(DO)、诱导时机、接种量等因素对重组大肠杆菌DH5α／pBV220生产rhG-CSF的影响．结果表明，在ω(D0)≥50％，茵体光密度D600≈4．50，42℃诱导表达4h的条件下rhG-CSF的茵体干重可达6．61g／L，表达量为38．1％．