MALDI质谱技术在酶活性分析中的应用

酶作为生物催化剂参与很多重要的生理过程,同时也是一类重要的生物分子。酶的活性分析对于疾病诊断和治疗具有重要意义。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)具有操作简单、分析速度快、灵敏度高和易于实现高通量分析的特点,已被广泛用于各种组学研究和生物分子的检测,在酶的检测和活性分析中亦发挥了重要作用。该文综述了国内外利用MALDI-TOF MS分析酶活性和进行药物筛选的策略,总结了各种方法的优缺点,提出了MALDI质谱技术在酶活性分析领域存在的问题和挑战,并对其发展前景进行了展望。     

基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在微生物鉴定中的应用*

基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种新型软电离生物质谱,具有检测速度快、操作简便、结果准确等优点,目前已成为可靠的微生物快速鉴定技术。就工作流程而言,与常规生化方法相比,MALDI-TOF MS可以将微生物鉴定的时间缩短为一天甚至更短。对于具有抗生素耐药性的微生物,使用MALDI-TOF MS鉴定也有很好的准确性。在病毒鉴定中,MALDI-TOF MS也可以发挥作用,已有报道将MALDI-TOF MS和机器学习(ML)分析方法结合来检测鼻拭子中SARS-CoV-2。此外,MALDI-TOF MS还可用于细菌的无光谱库鉴定。目前,MALDI-TOF MS正通过与其他技术(例如傅里叶红外光谱FTIR)相结合进一步扩大微生物鉴定范围。     

基于MALDI-TOF质谱技术分析人宫颈癌 HeLa细胞N-糖链结构轮廓

以微量HeLa细胞(10⁷个)为对象, 经细胞裂解、还原羧甲基化、胰酶降解和Oasis-HLB柱提取分离得到总糖肽后, 用PNGase F酶解释放N-糖链. 对所得N-糖链用Sep-Pak C₁₈柱纯化后进行完全甲基化衍生, 再采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析HeLa细胞表面N-糖链的结构轮廓. 结果表明, 在获得的34种N-糖链中, 除高甘露糖型、二天线、三天线、四天线和五天线等N-糖链外, 还出现了在某种程度上与肿瘤发生转移相关的特殊平分型和Lewis结构. 利用MALDI-TOF MS技术可快速分析微量癌细胞表面N-糖链的结构轮廓, 为进一步寻找肿瘤糖链标志物及肿瘤的早期预防诊断提供技术支持.     

MALDI－TOF－MS法分析人血清白蛋白

用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）法分析测定了人血清白蛋白。结果表明，全军血液制品研究中心应用Ｒｉｖａｎｏｌ和Ｃｏｈｎ＇ｓ两种方法分离提取的人血清白蛋白，其分子量与理论计算值相吻合，其纯度与市售标准人血清白蛋白相一致，用ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ法分析鉴定人血清白蛋白，准确、简便和灵敏（仅需ＰＭ浓度样品），且重复性好，日内和日间差的变异系数均小于０．０３％，是ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳法所无法比拟的。     

基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构

建立了生物质谱研究rhEPO一级结构的系列方法,包括分子量、唾液酸含量以及N-糖含量等糖基化性质的测定方法,并用于4种国产rhEPO样品的分析;在此基础上优化酶切条件,使测定的肽质量指纹谱(PMF)的覆盖率均达到98%,成功鉴定了4个样品中的全部N-糖基化位点以及对分子中两对二硫键进行了结构确证,测定4个样品分子量分别为27754.1±27.4Da、27941.4±23.2Da、27682.5±22.0Da和27914.7±22.5Da;唾液酸含量分别为5.0%、4.8%、5.6%和5.4%;糖含量分别为34.3%、34.7%、34.1%和34·6%。此外还对4种产品在O-连接糖型及N-连接糖型上的区别做了初步探讨。     

利用MALDI-TOF质谱技术研究MPEG-b-PCL两嵌段共聚物的嵌段长度及嵌段分布

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)结合源后分解(PSD)技术对甲氧基封端的聚乙二醇-b-聚己内酯(MPEG-b-PCL)两嵌段共聚物进行了结构分析. 根据得到的MALDI-TOF MS谱图和PSD碎片信息清晰地确定了嵌段共聚物的嵌段长度和嵌段分布. 结果表明, 采用MALDI-TOF MS结合PSD技术研究这类嵌段共聚物链结构非常有效. 这为更好地认识和应用这类嵌段共聚物提供了重要的依据, 同时也建立了分析这类嵌段共聚物的方法.     

糖的基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)研究

通过糖类化合物3种常用基质MALDI-MS分析效果的比较以及寡糖和多糖正、负离子MALDI-MS谱的对比,找到了适合糖分析的基质2,5-DHB,探讨了糖类化合物激光解吸/电离条件下形成离子的过程,指出了Na⁺、K⁺离子在寡糖分子量测定中的重要作用,借助柱层析分离手段,成功地测出了分子量大于10000的葡聚糖的分子量。     

基因重组糖蛋白-人尿激酶原糖基化修饰的质谱测定

酶法结合生物质谱技术测定了基因重组糖蛋白-人尿激酶原(rhProUK)的N-糖含量、唾液酸含量分别为9％和5％。糖蛋白／肽先经Con A凝集素亲和富集,肽：N-糖苷酶F(PNGaseF)对N-糖基化位点进行特异性质量标记,然后利用Lc-MS/MS技术测定出N-糖基化位点在第302位天冬酰胺残基上。     

亲和标记-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于蛋白质相对定量方法的研究

将亲和标记技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱联用,建立了蛋白质相对定量方法,以牛血清白蛋白为实验对象,考察了该方法的准确度、重现性等指标;又以数种标准蛋白混合物为研究对象,考察了该方法的动态范围及相应的标准偏差,为实际生物样品中差异蛋白质分析奠定了基础。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对中药材霉菌污染的快速鉴定

通过N-烷基吡啶同位素季铵化反应(NAPIQ)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对中药材的霉变情况进行了快速鉴定。运用氯仿对中药材中的甾醇进行提取后,以吡啶、氘代吡啶以及三氟甲磺酸酐作为衍生化试剂对提取出的甾醇进行衍生化反应以提高其质谱响应,并利用MALDI-TOF MS进行检测。利用该方法在新鲜的药材中仅检测到谷甾醇、豆甾醇等植物甾醇,而在霉变的药材中,除了植物甾醇外,还检测到羊毛甾醇等动物甾醇以及麦角甾醇等菌类甾醇。将该方法与药典中的微生物计数法进行了对照,在只检测到植物甾醇的新鲜药材中未发现霉菌,而在产生了动物甾醇和菌类甾醇的霉变药材中检测到的微生物数均大于药典规定的10~2 cfu/g,证明了该方法符合药典标准,可以对中药材受霉菌污染的状况进行快速评价。     

Synthesis and characterization by MALDI-TOF MS of polycyclic siloxanes derived from p-substituted novolac resins by MALDI-TOF MS

Novel polycyclic siloxane resins were prepared from phenol-formaldehyde novolac type resins by reacting them with dialkyl or diaryl dichlorosilanes under anhydrous and high dilution conditions. The formation of polycyclic species was confirmed by the detection of absolute masses by MALDI-TOF mass spectrometry. ¹H- and ²⁹Si-NMR confirmed the substitutions of phenolic hydroxy groups by siloxane bonds. Curing studies were conducted on the polycyclic siloxane resins as well as on the polycyclic siloxane resins incorporated into two types of polysiloxane gums. A trace amount of potassium hydroxide was used as a catalyst for the crosslinking of these systems. The blend of polysiloxane with 30 wt % polycyclic siloxane was found to be stable at the curing temperature. Differential scanning calorimetry and thermogravimetric analysis techniques were used to study the thermal profiles of these systems. © 1998 John Wiley & Sons, Inc. J. Polym. Sci. A Polym. Chem. 36: 2429–2437, 1998     

一种液相色谱分离与质谱鉴定白血病K562细胞蛋白的方法

分别通过3种色谱模式:反相高效液相色谱(RPLC)、弱阴离子交换-反相高效液相色谱(WAX-RPLC)和排阻-反相高效液相色谱(SEC-RPLC)对K562细胞的蛋白质进行分离,收集的色谱馏分采用基质辅助电离解析时间飞行质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定后,比较所获得的蛋白质数据.结果显示:当选择SEC-RPLC模式构建K562细胞蛋白质图谱时,检测到的蛋白质数目最多,信息最为全面.此法的建立为白血病的临床研究提供了一种有效的手段.     

反相高效液相色谱/基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 分离鉴定螺蛳血管紧张素转换酶抑制肽

运用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对酶解螺蛳腹足肌得到的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽进行两步分离提纯,第一步主要得到8个组分;选取其中活性最高的组分进一步分离,得到2个组分,其中活性较高组分的ACE半抑制浓度为43.5 μmol/L,基本为单一肽组分。对提纯的组分分别使用高效液相色谱/电喷雾离子质谱法(HPLC/ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)进行分析,同时结合氨基酸组成分析结果,最终得到的肽链一级结构为Lys-Glu-Ile-Trp(KEIW),符合已知的高活性ACE抑制肽的结构规律。经过对两种方法分析过程的比较,认为ESI-MS可以得到多方面的信息,但无法确定肽的序列;MALDI-TOF MS可以得到精确的二级质谱图(m/z精确至0.0001),从而可以得到确定的肽的序列。     

基于MALDI-TOF MS的串联富集策略在磷酸化蛋白组学中的应用

提出一种除盐-富集串联用于磷酸肽富集研究的思路。选用C18柱和铈(Ⅳ)修饰的壳聚糖材料进行脱盐实验,以制备的基于聚合物基体螯合Fe3+的亲和色谱材料为富集材料。将直接富集和串联策略应用到标准品和血清中,研究结果表明,该富集材料具有高选择性和高灵敏度(1.6 fmol),铈(Ⅳ)修饰的壳聚糖材料前提下的串联策略能明显降低样品的复杂性。相比直接富集方法,能够提高磷酸化肽的覆盖率。     

多金属氧酸盐/壳聚糖磁性复合材料的制备及其用于磷酸化肽的富集

建立了一种基于多金属氧酸盐磁性材料富集磷酸化肽的方法。采用层层自组装技术制备多金属氧酸盐/壳聚糖磁性材料,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测手段,用于磷酸化肽的富集。该磁性材料具有快速磁响应、亲水性、正电性等优点,对磷酸化肽具有高的富集选择性。实验用β-酪蛋白作为模型蛋白质,通过富集后,方法的检出限为0.02 fmol,说明合成的磁性材料对微量蛋白样品分析具有很高的应用潜力。     

伴刀豆球蛋白亲和色谱柱的制备及其在糖蛋白核糖核酸酶B结构分析中的应用

通过对硅胶基质进行化学改性键合伴刀豆球蛋白(Con A),制备了对糖蛋白具有特异亲和作用的亲和色谱固定相;该固定相非特异性吸附弱,对于糖蛋白和糖肽的分离效果良好。对亲和色谱的分离条件进行了优化,以标准糖蛋白核糖核酸酶B(RNase B)为模型,对其进行了纯化;用糖苷酶切除糖链,并对切除糖链前后的RNase B用胰蛋白酶酶解;用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对亲和色谱分离得到的糖蛋白、糖链及糖肽进行了分析,确定了RNase B的一级结构、糖含量、糖基化位点及糖连接方式。该方法快速准确,适于糖蛋白和糖肽的分离表征。将其应用于血清中糖蛋白及酶解后血清中糖肽的分离富集,取得了很好的效果。     

MALDI-TOF MS测定多肽类聚合物相对分子质量的条件优化

本文用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱来测定多肽类聚合物的相对分子质量,对基质、溶剂以及添加阳离子条件进行了优化。     

反相高效液相色谱法测定康肾颗粒中的葛根素

建立了反相高效液相色谱分离、质谱定性、紫外检测定量测定康肾颗粒中葛根素含量的方法。采用YMC-ODS色谱柱(4.6 mm i.d.×100 mm,10 μm),选用甲醇(含0.1%三氟醋酸)和水(含0.1%三氟醋酸)体系为流动相,非线性梯度洗脱分离,流速1.0 mL/min,检测波长250 nm;用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析鉴定对照品和样品的馏分,在确定目标峰后进行紫外检测定量测定。结果表明,葛根素在0.132 ~1.32 μg范围内其峰面积与进样量呈良好的线性关系（r=0.9997）,平均加标回收率高于103%,相对标准偏差低于2.0%(n=6)。应用该方法测定康肾颗粒中葛根素,其平均含量为3.09 mg/g。该方法简单、快速、重现性好。     

MALDI-TOFMS表征均聚芳香硫酚环状低聚物

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对4种合成的均聚芳香硫酚环状低聚物进行了质谱表征;并且对4种合成产物的组成、结构进行了分析及确认;得到了均聚芳香硫酚环状低聚物的相对分子质量及其分布信息;研究结果显示：MALDI-TOF MS是分析均聚芳香硫酚环状低聚物的有效工具。