满江红鱼腥藻glnA基因上游调控区的克隆及其序列分析

以满江红鱼腥藻（Ａａｃ）提取总ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ技术,扩增得到其谷氨酰胺合成酶基因（ｇｌｎＡ）上游区．经酶切得到４０９ｂｐ的片段,并将其连接到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡｋｓ＋上测序．将测序结果与Ａｎａｂａｅｎａ７１２０调控序列比较,有９８２％的同源性．在上游调控中也具有ｎｉｆｌｉｋｅ和Ｅ．ｃｏｌｉｌｉｋｅ启动子,值得注意的是,调节蛋白ＶＦ１的结合位点正好位于ｎｉｆｌｉｋｅ启动子上．所克隆的片段不但对蓝藻固氮、泌氨的基因调控研究具有意义,也对表达载体的构建具有实用价值．     

转基因满江红鱼腥藻细胞内颗粒体的变化

用透射电镜观察NPTⅡ(新霉索磷酸转穆酶Ⅱ eomycin phosphotransferase Ⅱ)在满江红鱼腥藻染色体gI-LA(谷氨酰氪合成酶基因)位点定点整合后藻细胞内颗粒体的变化．转基因后的满江红鱼腥藻细胞内的代谢发生了很大的变化，为了快速适应和自我调节这一变化．细胞内的储藏颗粒处在积聚与解积聚的动态转化过程中．通过了解储藏颗粒的结构变化，可为研究转基因藻细胞光合同氮及生理生化的变化提供物质结构方面的信息．     

NPTⅡ基因在满江红鱼腥藻染色体DNAglnA位点的定点整合及对泌氨和细胞形态结构的影响

本研究构建了含glnA基因片段和TPTⅡ基因的单交换整合型重组质粒pGN1-4,并通过电激法,三亲接合转移和二亲接合转移法号入到满江红鱼腥藻细胞中。用蓝细菌原位杂交法筛选出转化细胞菌落。再经Southern杂交方法进一步证实了转化结果。化学测氨法表明,培养后7～14d泌氨达到高峰,转化细胞泌氨比对照高40％。光镜观察表明,转化细胞藻丝变短,易断成单个细胞,异形胞频率降低;扫描电镜观察指出,转化细胞外壁有鳞片状鞘层,而对照较光滑。     

盐生盐藻肌动蛋白基因及其5‘上游片段的克隆

在盐生盐藻cDNA文库和基因组文库中对肌动蛋白基因进行了筛选,结果得到了一个cDNA克隆和两个基因克隆,并进一步从基因克隆中克隆出该基因的5'上游片段,检索结果表明,所得到的cDNA和基因属于盐生盐藻的肌动蛋白基因。通过将盐生盐藻肌动蛋白基因序列同其cDNA序列及其他生物的肌动蛋白序列相比较,给出了一个此基因5'上游区大概的结构。     

PCR法克隆卤虫（Artemia franciscana） Artemin基因上游调控序列

利用限制性内切酶(Dra I和Hpa I)对卤虫(Artemia franciscana)基因组DNA进行酶切后，连上接头构建基因组“DNA文库”(即未克隆，带接头的DNA片段)，再以TD-PCR(Touch-down PCR)的方法扩增卤虫的Artemin．基因的上游调控序列，得到一段大为750bp的片段，将这一上游序列片段克隆到pMDl8-T载体中，以获得包括启动子、增强子等顺式作用元件在内的Artemin基因的上游调控序列，为进一步研究Artemin基因的表达模式及其功能提供依据。     

黑曲霉T21 glaA 5′上游调控区的两个蛋白结合因子及其靶序列

采用凝胶阻滞法从糖化酶高产株黑曲霉（Aspergillus niger)T21部分纯化的蛋白提取液中检测到与糖化酶基因（glaA)5′cis调控区特异结合的两个蛋白因子，其一的靶DNA定位在glaA翻译起始点（ATG）上游－580～－509及－318～－254bp两个区域，另一蛋白因子的靶DNA定位在－809～－580区域。－580～－509序列含有“TATA”的重复结构，－318～－254序列富含“GC”以及－809～－580序列含有CCAAT的特点暗示此3片段及其所结合的蛋白因子在A．niger T21 glaA的表达调控中可能有重要作用。     

盐藻启动子活性片段的克隆及序列分析

报道了以启动子探测质粒pECE7为载体克隆盐藻（Dunaliella salina)中具有启动子活性DNA片段的研究。经限制性内切酶EcoR I分别消化盐藻基因组DNA和质粒pECE7,并进行体外重组及转化筛选，得到一具有启动子活性的DNA片段Ped。经进一步氯霉素抗性筛选，证明此启动子具有较高的活性。测序结果显示Ped长243bp。对其序列分析表明它具有启动子初级结构的基本特征。Southern杂交显示此启动子片段确实来自于盐藻基因组，且其广泛存在于整个基因组中启动盐藻基因的表达。经推测，Ped中含有多种转录因子结合位点的同源序列，因此Ped可能参与了多基因表达的调控。     

盐生盐藻肌动蛋白基因及其5′上游片段的克隆

在盐生盐藻 c DNA文库和基因组文库中对肌动蛋白基因进行了筛选 ,结果得到了一个c DNA克隆和两个基因克隆 ,并进一步从基因克隆中克隆出该基因的 5′上游片段 .检索结果表明 ,所得到的 c DNA和基因属于盐生盐藻的肌动蛋白基因 .通过将盐生盐藻肌动蛋白基因序列同其c DNA序列及其他生物的肌动蛋白序列相比较 ,给出了一个此基因 5′上游区大概的结构     

甘蓝型油菜Toc33基因启动子的克隆及序列分析

叶绿体是植物细胞中重要的细胞器,大部分叶绿体蛋白质都是由核基因组编码,在细胞质中合成分子量较大的前体蛋白,转运至叶绿体实施其功能．TOC33／TOC34是叶绿体上发现的一个外膜蛋白转运器构件蛋白,它与TOC159、TOC75和TOC64相互作用,构成了叶绿体外被膜上的一个蛋白转运器．目前已从豌豆（Pisumsa tizrurn）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus）和油菜（Brassica napus）克隆到TOC33或TOC34的cDNA或DNA的编码区．与其功能研究相比,Toc33基因的表达调控研究较少,该基因5’端调控区域的克隆及序列分析均未见报道．为此,在本实验室已经克隆到甘蓝型油菜Toc33基因编码区的基础上,采用单引物PCR方法进行染色体步移,克隆出Toc33基因的启动子,为进一步研究Toc33基因的转录调控机制奠定基础．     

扬子鳄DMRT1基因DM保守区的克隆及序列分析

DMRT1基因是DMRT基因家族的一个重要成员,在动物性别决定过程中发挥重要作用.本文参照人DMRT1基因DM保守区及有关文献,设计了一对简并引物,扩增了扬子鳄的DMRT1基因,并对扩增产物进行了亚克隆与测序.结果在雌雄扬子鳄个体中各获得一个预期的基因片段,长度为140bp,序列无性别差异性,命名为扬子鳄AsDMRT1基因.序列同源性分析表明,扬子鳄DMRT1基因DM盒区核苷酸序列与人和鼠相应基因的同源性分别为87%、86%;编码的氨基酸序列与人和鼠相应基因编码序列的同源性分别为95%、97%.充分显示了DMRT1基因在进化上的高度保守性.     

水稻硝酸还原酶基因5′上游序列的克隆与序列分析

以日本晴水稻幼苗叶的基因组总DNA为模板,采用PCR方法扩增获得约1 300 bp大小的DNA片段,回收该片段并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌感受态,并提取质粒DNA.用凝胶电泳检测和酶切鉴定,选取阳性克隆进行测序分析.测序结果显示,该片段含1 376个核苷酸对;应用NCBI网站的BLAST软件对本试验中克隆的序列与GenBank(NC_008401)公布的水稻硝酸还原酶基因启动子序列进行比对,有3个核苷酸差异,同源性为99%,证实本试验中克隆的DNA序列为水稻硝酸诱导基因启动子.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box).此序列的成功克隆,为今后开展水稻等重要农作物转基因研究奠定基础.     

绵羊β—乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法学研究

本对绵羊β-乳球蛋白基因5′端及上游调控序列的PCR扩增的方法扩增进行了研究。经比较分析,将从羊血中提取的绵羊基因组DNA的模板用量定为4μl(0.4μg/μl）,TaqDNA聚合酶用量为0．83μl(3u/μl）,变性为94℃1min,退火为64℃1min72℃延伸2min,循环次数为32次,获得的PCR产物经电泳检测,条带明亮,特异性高,大小为898bp。经序列分析发现,与已知基因组序列一致性达99％以上,可用于指导外源基因在转基因动物乳腺中表达。     

甘蓝型油菜MADS-box基因家族APETALA3基因编码区的克隆与序列分析

随着对植物花发育分子机制研究取得的重大进展，通过对双子叶植物拟南芥和金鱼草的花同源异型突变体的研究确定了花器官发育的“ABC模式”，初步揭示了植物花发育的奥秘．在拟南芥中，属于A类基因的有APETALA1(AP1)和APETALA2(AP2)，属于B类基因的有APETALA3(AP3)PISTILATA     

抑癌基因FHIT的克隆和序列分析

用ＰＣＲ方法，从人脑ｃＤＮＡ库中克隆ＦＨＩＴ基因，扩增得到５５３ｂｐ片段克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ载体，测定了其ＤＮＡ序列。该序列包括ＦＨＩＴ ｃＤＮＡ编码区全部４４４ｂｐ，以及５‘端５２ｂｐ和３’端５７ｂｐ非编码区序列。编程区有二处位点发生突变，第９２位密码子中的Ｃ突变成Ｇ，是同义突变，不导致氨基酸改变；     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因的克隆及序列分析

根据U．Washington报导的根癌土壤农杆菌(Agribacterium tumefaciens)C58Ti质粒基因序列，设计1对引物，利用PCR的方法扩增了c58根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因。通过琼脂糖凝胶电泳，所得E1的片段略小于500bp，与引物设计跨幅片段476bp相吻合。将此片段连接到T载体，经蓝白斑筛选、PCR鉴定、测序及DNA序列分析，结果表明：克隆VirD1基因编码序列与报导的序列同源性达100％，说明通过PCR方法获得的VirD1基因片段是正确的，为进一步研究该基因的表达和活性奠定了基础。     

土曲霉CCTCCAF93044植酸酶基因的克隆及序列分析

参考Hartingsvedt已发表的NRRL3135植酸酶（phyA）基因序列,设计并合成了一对引物,应用PCR技术,以土曲霉CCTCCAF93044总DNA为模板,扩增出了不包括假定的信号肽序列的phyA基因,并将其克隆到PMD18－T载体上,测定了其核苷酸序列,并推导了其氨基酸序列,该基因全长为1433bp,与已发表的NRRL3135的phyA基因的同源性为97％,编码一个含458个氨基物的蛋白质。     

蓖麻PsbO基因的克隆与序列分析

用实验室栽培的蓖麻新鲜叶片为材料,Trizol法提取总RNA,参照GenBank公布的植物PsbO氨基酸序列,进行序列比对找出氨基酸序列保守区设计简并引物,通过RT-PCR扩增目的片段,纯化后克隆到T-Vector中测序,获得蓖麻的PsbO基因,对其基因序列进行分析。了解到其长度为1081bp,5＇非编码区为10bp,3＇非编码区为273bp,编码区长798bp,编码266个氨基酸。序列分析结果表明,蓖麻PsbO基因编码的氨基酸序列与已公布的其他植物中克隆到的PsbO氨基酸序列有较高的同源性。     

小菜蛾泛素基因的克隆及序列分析

设计了一对简并引物,从小菜蛾Plutella Xylostella(L.)抗溴氰菊酯品系和敏感品系的雌雄成虫基因组中分别克隆了泛素基因的编码区,GenBank登录号分别为EU28778,EU28779,EU28780,EU28781.序列分析表明,该基因的长度为228bp,编码的多肽由76个氨基酸组成.不同品系和不同性别的小菜蛾泛素基因的核苷酸序列、氨基酸序列等均存在差异,其中敏感品系雌雄成虫间差异较大,序列相似性为81.1%;抗性品系雌雄成虫间差异较小,序列相似性为97.8%.推测这些差异可能与小菜蛾抗药性的形成有关.因而为进一步研究小菜蛾抗药性形成机制和遗传机理奠定了基础.     

马铃薯卷叶病毒中国分离株外壳蛋白基因及其上游先导序列的cDNA克隆和序列分析

按照马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）核苷酸序列，针对ＣＰ基因及其上游基因间隔区全长约０．８ｋｂ的区段设计合成两个特异性引物，以马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）的ＲＮＡ为模板，反转录合成ＣＤＮＡ第一条链，再经ＰＣＲ扩增合成ｃＤＮＡ，将ＣＤＮＡ克隆于ｐＵＣ１９质粒．限制性酶切分析和核苷酸序列测定表明克隆的ＰＬＲＶ－Ｃｈ外壳蛋白（ＣＰ）基因及其上游基因间隔区的全长ＣＤＮＡ共８２４个核苷酸，与国外报道的４个ＰＬＲＶ分离株的核苷梳序列相比具有高度同源性．ＰＬＲＶ的外壳蛋白基因序列与其上游基因间隔区相比保守性更强．