新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

谷氨酰胺合成酶基因的过量表达有效提高谷氨酸棒杆菌中L谷氨酰胺产量

以谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032基因组为模板,通过PCR扩增,得到大小为1434bp的谷氨酰胺合成酶基因glnA.以大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19为载体,将扩增得到的目的基因片段克隆至C.glutamicum Res167,获得重组菌株C.glutamicum Res167/pXMJ19-glnA.在摇瓶发酵水平上,通过IPTG诱导glnA基因的表达,并采用反相高效液相色谱方法测定了发酵液中的L-谷氨酰胺含量.结果显示,与未经诱导的对照菌相比,诱导后的重组菌发酵液中的L-谷氨酰胺产量提高了1.8倍,最高产量达1.54·gL-1.     

重组大肠杆菌中NTA的发酵与表达优化

研究诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间、锌离子以及在发酵培养基中组合添加乳糖对提高重组新型溶栓酶外源蛋白的表达效率的作用,结果表明：IPTG诱导效果优于乳糖,IPTG诱导浓度选择1．5mmol·L^-1,诱导时机选择菌体OD600接近4．0时,诱导后的最佳培养时间为6h,加入1．0g．L^-1的ZnCl2后,外源蛋白表达可提高40％,发酵结果提高29．8％．在培养基中组合加入微量的乳糖,可以使外源蛋白的表达效率提高10％~15％．     

新型含BPP34C10冠醚双吡啶双齿配体的合成

以Sonogashira偶联反应为关键反应来合成化合物4.设计并且用Suzuki偶联反应为关键反应,合成了新型含BPP34C10冠醚的180°双吡啶双齿配体.该双吡啶双齿配体有两个配位点,有望和铂受体用于自组装成新型的超分子建筑.     

基于聚硅氧烷双功能低玻璃化温度聚合物的合成与表征

介绍了一种新型双功能光折变聚合物材料的合成方法,首先在合成空穴传输体N-(5-己烯基咔唑)(HECZ)、非线性生色团4-腈基-4'-(5-己烯氧基)联苯(HEBP)液晶基元的基础上,与含氢聚甲基硅氧烷进行硅氢加成,合成双功能共聚物.采用红外光谱和核磁共振氢谱对产物进行了结构表征,并对最终共聚物进行偏光显微镜分析,发现该共聚物具有向列型液晶织构.共聚物DSC热分析测得玻璃化温度在室温以下-5 ℃,这类光折变聚合物不需要加入增塑剂可在室温以下极化.     

环加氧酶2基因的原核表达、抗体制备及其在肝癌中的表达

用PCR技术扩增环加氧酶2（COX-2）基因的C末端777bp的片段，插入到pET-28b（＋）中，构建原核表达载体．转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导产生包涵体形式his-COX-2融合蛋白．用镍离子螫合柱（Ni—NTA）纯化融合蛋白，获得纯度较高的原核表达蛋白．纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，用ELISA及Western blotting分别检测抗体．用此抗体Western blotting检测肝癌组织中的环加氧酶2的表达．ELISA及Western blotting结果显示免疫家兔所得的环加氧酶2抗体具有很高的效价，并能够特异性的识别真核细胞中的环加氧酶2．用此抗体检测肝癌组织中的环加氧酶2的表达．证实肝癌组织中伴随有环加氧酶2的大量表达．同时所得的环加氧酶2抗体具有很高的效价和特异性，为进一步研究环加氧酶2的功能提供了条件。     

温度对水稻谷氨酰胺合成酶和NADH-谷氨酸合酶表达的影响

测定了不同温度（32℃和23℃）培养下水稻幼苗根和叶的谷氨酰胺合成酶（GS）同工酶以及依赖于NADH的谷氨酸合酶（NADH－GOGAT）的活性变化。结果表明，温度对水稻根和叶的GS活性具有相反的作用。23℃下生长的水稻根的GS活性明显高于32℃下生长的活性，而23℃下生长的叶的GS活性显著低于生长在32℃下的叶的活性。Native-PAGE和活性染色以及蛋白质印迹表明，根和叶的GS活性变化主要是由于GSrb和GS2活性及其相应蛋白质水平变化所致。23℃下生长的水稻根的NADH－GOGAT活性显著高于32℃下生长的活性，而叶的活性则基本保持恒定。     

灵芝胞外多糖双液相发酵体系的特性

用豆油作为氧载体加入发酵液中形成双液相发酵体系,以改善灵芝胞外多糖的发酵状况.实验表明:常见的氧载体材料在双液相发酵过程中不为灵芝菌体所利用,仅起到促进溶氧的效果;在灵芝胞外多糖的双液相发酵体系中,KLa值明显提高,溶氧水平(DO)有显著改善,发酵液的运动黏度μ有所降低,有助于降低搅拌能耗;氧载体改善了质量传递,提高了细胞的代谢水平,使胞外多糖的产量提高了44%,发酵周期缩短了约17%.说明双液相发酵体系对灵芝胞外多糖发酵是一种新型有效的途径.     

纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备

纳豆激酶是一种源于日本传统食品纳豆且具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶．本研究将编码信号肽、前导肽和成熟肽在内的纳豆激酶基因克隆到原核表达载体pET28a^＋中,获得重组表达质粒pETNK．将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达．SDS-PAGE结果显示纳豆激酶在大肠杆菌中成功表达,表达的纳豆激酶融合蛋白分子量大约为31kD．亲和层析法纯化表达产物,并以此纯化产物作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗纳豆激酶血清,用ELISA和Western blotting对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定．纤维蛋白平板实验显示,表达的纳豆激酶融合蛋白具有较好的溶纤活性．     

类人胰岛素原多拷贝重复基因原核表达载体的构建与表达

根据大肠杆菌密码子偏好性,优化人胰岛素原基因序列,同时用2个赖氨酸取代C链。重叠PCR扩增法克隆优化的类人胰岛素原基因,PCR扩增引物中引入胰蛋白酶酶切位点和核酸限制性内切酶识别位点。经酶切、拼接获得类人胰岛素原多拷贝基因,并构建人胰岛素原基因多拷贝原核表达载体,转化感受态大肠杆菌诱导表达融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE电泳,考马斯亮兰染色和融合蛋白染色条带光密度分析表明,含有4拷贝的类人胰岛素原重复基因序列原核表达载体的诱导表达类人胰岛素原效率最高,是单拷贝类人胰岛素基因原核表达载体表达效率的3倍左右。表达产物经质谱鉴定,确定为优化设计的类人胰岛素原,表明构建的多拷贝类人胰岛素原基因表达载体可应用于后续人胰岛素原的高效表达生产研究。     

人乙醇脱氢酶ADH1B2在毕赤酵母中的表达及活性分析

根据GeneBank中人乙醇脱氢酶ADH1B2基因序列设计引物,以人肝脏总RNA为模板,反转录获得人乙醇脱氢酶基因.将克隆基因与表达载体pPICZB连接,测序正确的pPICZB-ADH1B2电转化毕赤酵母GS115;重组毕赤酵母工程菌经0.5%（v/v）甲醇诱导72 h后目的蛋白以可溶形式表达,经DEAE-Sepharose FF纯化后蛋白酶活性可达8 000 U·mg^-1.同时构建重组质粒pCDNA3.1-ADH1B2转染HepG2人肝癌细胞,发现细胞内ROS/GSH水平降低,Akt磷酸化水平降低,细胞活性下降.为临床酒精中毒预防和治疗药物的研发以及ADH在肝脏肿瘤方面的研究提供了理论基础.     

人白细胞介素10(hIL10)在毕赤酵母中的表达

利用PCR技术从质粒pcDNA3．1／GS扩增得到hIL10基因．将其插入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K／IL10，转化毕赤酵母GS115，筛选出整合了多拷贝白细胞介素10基因的菌株，经摇瓶培养，0．5％甲醇诱导表达、SDS-PAGE分析显示，表达产物以可溶性分子形式存在于上清中，诱导4d的表达量达到高峰．Western印迹表明．表达产物具有良好的抗原性和特异性．     

猪胃蛋白酶原A基因cDNA的克隆及其表达

根据GenBank中发表的猪胃蛋白酶原A（pepsinogen）基因序列设计引物，采用RTPCR技术，成功获得了猪胃蛋白酶原A基因，该基因全长1240bp，将该基因克隆到表达载体pPIC3．5K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点构建重组表达质粒，通过电转化方法将重组质粒转化毕赤酵母GS115，检测结果表明猪胃蛋白酶原A基因在毕赤酵母中得到了表达．     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

NaCl对水稻谷氨酰胺合成酶活性及同工酶的影响

在营养液中 Ｎａ Ｃｌ的胁迫下,水稻根和叶的谷氨酰胺合成酶（ Ｇ Ｓ）的活性降低,但叶的 Ｇ Ｓ活性对 Ｎａ Ｃｌ浓度的敏感性大于根根和叶中的 Ｇ Ｓ活性变化与根和叶的平均质量和可溶性蛋白水平的变化是一致的 Ｎａｔｉｖｅ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ活性染色以及 Ｉｍ ｍ ｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测表明,根和叶的 Ｇ Ｓ活性的降低主要是由于 Ｇ Ｓｒｂ 和 Ｇ Ｓ２的活性及其相应蛋白质水平降低所致     

mtPDI外源基因表达体系的构建及耐热性

二硫键异构酶(PDI)是1种重要的蛋白折叠酶,它催化蛋白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性。为了研究嗜热自养甲烷杆菌二硫键异构酶(mtPDI)的功能,克隆了mtP-DI基因的ORF区,构建了融合基因原核表达载体pET-28a(+)-mtPDI。将质粒pET-28a     

丝瓜种子萌芽及子叶生长过程中谷氨酰胺合成酶同工酶的变化

测定了丝瓜种子萌芽及子叶不同生长阶段的谷氨酰胺合成酶(GS)的活性及其同工酶的变化．除了发育上的变化外，光和外源氮对GS活性及其同工酶影响也是显著的．无论外源氮(N)是否存在，GS活性在种子萌芽和子叶生长初期是逐渐升高的，于第6天达到最大，其后活性逐步降低．在光照下，外源氮对GS1诱导作用大于GS2；在无氮下，光对GS2的刺激大于GS1；在暗处，外源氮对GS1和GS2两者都有诱导作用．