tRNA分子中修饰核苷酸的生物功能——Ⅲ.酵母tRNA类似物(A_(37),G_(37)或C_(37)代替m~1I_(37))的合成及生物活性

本文报道用牛脾磷酸二酯酶在控制条件下制备了去除37位m~(?)I的酵母丙氨酸tRNA3′-半分子(38—76核苷酸)。合成了由普通碱基A,G或C代替m~(?)I_(37)的酵母丙氨酸tRNA类似物。并测定了这些类似物的生物活性,结果表明与天然的酵母丙氨酸tRNA相比,这些类似物在鼠肝tRNA合成酶系统中接受丙氮酸的活力不受影响,而在兔网织蛋白质合成系统中携带丙氨酸参入蛋白质的活力却下降为天然tRNA的20—30％,对上述结果及牛脾磷酸二酯酶的作用条件进行了讨论。     

修饰核苷酸的生物功能——Ⅱ.酵母tRNA~(Ala)类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))的合成及生物活性

酵母tRNA~(Ala)的5′-半分子类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))与3′-半分子在T_4 RNA连接酶催化下连接成酵母tRNA~(Ala)类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))的整分子。合成的酵母tRNA~(Ala)类似物,在凝胶电泳上具有与天然酵母tRNA~(Ala)相同长度位置,其纯度为95％左右,连接点、末端分析都是对的。测定了这类似物的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,接受丙氨酸的能力与天然重组的酵母tRNA~(Ala)没有明显变化,而在兔网织细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去的能力,A_(34)代替I_(34)的只有天然或天然重组酵母tRNA~(Ala)的1/3,而G_(34)代替I_(34)的为90％左右。着重讨论了A或G代替I_(34)后,参入活力变化不同的原因。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成

本文报道采用有机合成与酶促合成相结合的方法,按照R.Holley等测定又经他人修正的一级结构,人工全合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的工作。我们合成的tRNA_y~(Ala)与天然的tRNA_y~(Ala)具有相同的化学组成(含有全部修饰核苷酸)和结构,并有完整的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,能接受丙氨酸,而且在兔网织红细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去。在进行全合成以前,曾分别进行了两种人工半合成,即将天然的5′半分子与人工的3′半分子和人工的5′半分子与天然的3′半分子进行连接,都取得有生物活力的整分子tRNA_y~(Ala)。据我们了解,这是世界上第一次用人工方法合成的具有生物功能的核糖核酸。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子(36—76)的合成

本文报告用T_4RNA连接酶将相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))3′-半分子(36—76)的三个寡核昔酸大片段——10(36—45)(Ⅰ),12(46—57)(Ⅱ)和19p(58—76)(Ⅲ)——从3′-端向5′-端延伸逐个连接合成了这个tRNA的3′-半分子(36—76)。首先在供受体配比为1:1.5的情况下,采取三步连续反应,即19p(Ⅲ)的5′-磷酸化,然后与12(Ⅱ)的连接和连接反应产物的5′-磷酸化等反应,一次制备分离的方法,以70％的总得率合成了5′-磷酸化的三十一核苷酸(46—76)(Ⅳ)。然后,以(Ⅳ)作为下一步反应的供体和三倍量的10(Ⅰ)连接,以67％的产率合成了具有四十一核苷酸的tRNA_y~(Ala)的3′-半分子(36—76)(Ⅴ)。将这个合成的3′-半分子,5′-磷酸化以后,与天然的5′-半分子连接,人工半合成了tRNA_y~(Ala)整分子,经生物活力测定,这个人工半合成的tRNA_y~(Ala)具有接受[~3H]-丙氨酸、并能将接受的丙氨酸转移到蛋白质分子中去的生物活力。     

人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸的生物活力测定

本文报道了用一种高灵敏度的方法测定人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的生物活力。tRNA_y~(Ala)在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下接受丙氨酸后,用操作简便而回收率较高的酒精沉淀法回收氨酰化产物,最后,在兔网织红细胞裂解液无细胞蛋白合成体系中,测定氨酰化产物中的丙氨酸转移到蛋白质中去的能力——参入活力。这方法不仅可以测定分离纯化的tRNA_y~(Ala)的活力,而且也可以测定经T_4RNA连接酶连接两个半分子后的反应混合物中产物tRNA_y~(Ala)的活力。利用这方法,已成功地测定了微至5—7 pmoles的人工全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力和参入活力两组数据。测定结果表明,全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力是天然分子的51.6—65.6％,是经拆合的天然分子的91.3—106.0％。其氨酰化产物中的[~3H]-Ala在兔网织红细胞裂解液中的利用率为61.6—63.1％,是天然分子的90.6—91.7％,是经拆合的天然分子的97.2—115.8％。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子(1—35)的合成

本文报道了应用T_4RNA连接酶将酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))5′-半分子中的三个寡核苷酸片段[—13(Ⅰ);14—22(Ⅱ);23—35(Ⅲ)]连接成5′-半分子的工作。由于寡核苦酸片段的纯度高,多核苷酸激酶和T_4RNA连接酶的质量好,采用连续反应的方法,简化了分离步骤,使产物的得率大大提高,二十二核苷酸的连接率是75％,三十五核苦酸的连接率是90％,以第一步反应原料为基数计算,最终产物的总得率是21％。经连接点和末端核苷酸分析,证明它的结构是正确的。将合成的5′-半分子与天然的3′-半分子在T_4RNA连接酶的催化下连接成人工半合成的完整tRNA_y~(Ala),具有接受[~3H]-丙氨酸和将[~3H]-丙氨酸转移到蛋白质中的生物活力。     

锤头状Ribozyme在修饰核苷酸ψ3′侧的定点剪切

现有知识所知道的锤头状Ribozyme结构中,剪切是在特殊位点的3′侧发生,我们将含GTΨ的酵母丙氨酸tRNA 3′半分子(40聚)作为底物,按Haseloff-Gerlach锤头结构模型设计了一个38聚的Ribozyme分子。在镁离子存在的条件下,GTΨ的3′侧发生预期的体外剪切反应。反应的米氏动力学参数为:K_m:6.7μmol/L,k_(cat):3.4×10~(-3)/min。与此同时,合成了一个17聚的底物类似物,仅以GUU代替上述的GTΨ序列。恒态动力学分析表明,两底物的K_m值大致相同,但k_(cat)值相差达294倍。实验表明,修饰核苷酸Ψ可以是Ribozyme锤头结构中的剪切位点,但具有很低的k_(cat)。     

核酸化学研究 Ⅴ.修饰的核苷酸和寡核苷酸的合成

本文叙述的修饰核苷酸——假尿嘧啶核苷酸的合成以及它和胸腺嘧啶核苷酸的保护,酵母丙氨酸转移核糖核酸TψC臂中CpCpGpG和TpψpCpG的合成.CpCpGpG和TpψpCpG均已圆满地用于t-RNA_y~(Ala)的3'-半分子合成和整分子的全合成.     

核酸化学研究V.修饰的核苷酸和寡核苷酸的合成

本文叙述的修饰核苷酸-假尿嘧啶核苷酸的合成以及它的胸腺嘧啶核昔酸的保护,酵母丙氨酸转移核糖核酸TΨC臂中CpCpGpG和TpΨpCpG的合成.CpCpGpG和TpΨpCpG均已圆满地用于t-RNA~Y^Ala的3'-半分子合成和整分子的全合成.     

SYNTHESIS AND DETERMINATION OF THE BIOLOGICAL ACTIVITIES OF YEAST ALANINE tRNA ANALOGUES

The role of base modification in yeast tRNAAl(?) function in protein synthesis was examined by the use of unmodified tRNA analogues. Unmodified full length tRNAs, 5'-half tRNAs (nucleotides 1-35) and 3'-half tRNAs (nucleotides 37-75) were transcribed in vitro using T7-RNA polymerase. Unmodified tRNA half molecules were joined to normally modified half molecules (5'-half, nucleotides 1-36; 3'-half, nucleotides 36-75) by T4-RNA ligase. Using this method, we synthesized three analogues of yeast tRNAAl(?): (i) tRNAAl(?) which lacks base modifications in the 5'-half of the molecule; (ii) tRNAAl(?) which lacks base modifications in the 3'-half of the molecule; and (iii) tRNAAla completely lacking base modifications. We determined the biological activities of these analogues. In rat aminoacyl-tRNA synthetase reactions, the alanine acceptance activity decreased by 52%, 79% and 85% when modified bases were absent from the 5'-half molecule, the 3'-half molecule or the total molecule, respectively. In rabbit retic     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3'-端十九核苷酸(58-76)的合成

研究了两个低聚核糖核苷酸的3′-端磷酸化方法.以3′-端带磷酸单酯的低聚核苷酸为供体,用T_4 RNA连接酶将AUUC,CGGA,CUCGUCCA和CCAp等按低的供受体摩尔配比(1∶1.1至1∶2),以87～90％的连接率合成了相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端53～76核苷酸顺序的十九核苷酸AUUCCGGACUCGUCCACCAp.     

稀土元素对3′-腺嘌呤及3′-鸟嘌呤核苷酸的水解断裂作用

用核磁共振(NMR)波谱、HPLC和化学定磷法研究了稀土元素对3′-腺嘌呤核苷酸(3′-AMP)及3′-鸟嘌呤核苷酸(3′-GMP)的水解断裂作用,结果表明:不同稀土元素对3′位核苷酸断裂有较强的特异性,在37℃,pH 9的条件下,使3′-AMP断裂为腺嘌岭核苷(A)及无机磷,使3′-GMP断裂为鸟嘌呤核苷(G)及无机磷,其断裂作用远大于5'位核苷酸,并对其水解断裂进行了研究.     

稀土元素对3'-腺嘌呤及3'-鸟嘌呤核苷酸的水解断裂作用

用核磁共振(NMR)波谱、HPLC和化学定磷法研究了稀土元素对3'-腺嘌呤核苷酸(3'-AMP)3及3'-鸟嘌呤核苷酸(3'-GMP)的水解断裂作用, 结果表明: 不同稀土元素对3'位核苷酸断裂有较强的特异性, 在37℃, pH9的条件下, 使3'-AMP断裂为腺嘌呤核苷(A)及无机磷, 使3'-GMP断裂为鸟嘌呤核苷(G)及无机磷, 其断裂作用远大于5'位核苷酸, 并对其水解断裂进行了研究。     

一个亲脂的环腺苷酸类似物的合成及其活性

基于高度亲脂的分子可能增强对神经细胞膜的渗透力的设想,合成了一种新的环腺苷酸的类似物2'-O-oleoy1-2-(?)aza-adenosine 3',5'-cyclic phosphate(3),发现在10~(-3),10~(-4)和10~(-5)M时,该化合物对小鼠神经胶质癌组织培养细胞的杀灭率分别是97%,86%和60%。     

活性维生素D3类似物的合成及构效关系研究

1α,25-二羟基维生素D₃(1α,25-(OH)₂-D₃,125D)是维生素D中最具生理活性的代谢产物,但因高钙血症副反应而限制其临床应用。从对构效关系的研究出发,迄今已合成三千多种类似物。本文综述了近年来对某些A环修饰(C2位修饰、C3位修饰、芳香A环类似物、A环开环类似物)、侧链修饰、CD环修饰、seco-B环修饰和非开环甾体的活性维生素 D₃ 类似物的设计、合成以及构效关系的研究,旨在为新型较佳活性维生素D₃类似物的合成及临床开发提供参考。     

用3′末端氧化的精氨酸tRNA亲和标记大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶

用3′末端氧化的精氨酰tRNA共价修饰大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶,酶的ATP-PPi交换活力和氨酰化活力完全丧失。用SDS-PAGE分析酶与tRNA(?)形成的共价复合物发现:伴随着酶的失活,形成了两种形式明显不同的ArgRS-tRNA(?)复合物,它们对应于凝胶上两条迁移率不同的大分子条带。这一结果与其它合成酶亲和标记的结果不同。ArgRS-tRNA(?)经RNase处理后,ATP-PPi交换活力和氨酰化活力均有部分恢复(小于15％)。在整个标记过程中,酶的两个活力是紧密相关联的。     

巯基修饰寡聚DNA包覆的CdS纳米粒子

用5'－端的1－C,2-C位之间磷酸根上修饰有巯基的寡聚胞嘧啶(oligoC10-SH)和矣鸟嘌呤(oligoG10-SH)作为包覆剂直接合成了CdS半导体纳米粒子。实验结果表明CdS的表面的寡聚DNA仍可进行正常的复性,并且复性后CdS的荧光发生了有利于DNA分子标识的显著增强。     

巯基修饰寡聚DNA包覆的CdS纳米粒子

用5'－端的1－C,2-C位之间磷酸根上修饰有巯基的寡聚胞嘧啶(oligoC10-SH)和矣鸟嘌呤(oligoG10-SH)作为包覆剂直接合成了CdS半导体纳米粒子。实验结果表明CdS的表面的寡聚DNA仍可进行正常的复性,并且复性后CdS的荧光发生了有利于DNA分子标识的显著增强。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸双氢尿核苷(D)环区九核苷酸(14-22)的合成

用有机合成或酶促合成的AGDCGG为受体,以过量的pDAGp为供体,应用T_4RNA连接酶,成功地合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的双氢尿核苷(D)环区九核苷九磷酸AGDCGGDAGp.在脱去3’-端磷酸基团后,得九核苷八磷酸.产物经序列分析证明,与AGDCGGDAG完全符合.本文也进行了相应于D环区九核苷酸的组成片段AG,AGDC,GG,GGp和DAG的5’-磷酸化和它们之间连接的条件探索,发现了3’-DMP和DAG的5’-磷酸化需在5～10℃下进行,可获近定量的产率. AGDCGGDAGp已用于tRNA_y~(Ala)的全分子合成.     

瘦肉型猪(PIC344)精液酸性磷酸酶功能基团的化学修饰

不同浓度化学修饰剂二巯基苏糖醇(DTT)、对氯汞苯甲酸(pCMB)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、溴代乙酸(BrAc)的修饰能抑制瘦肉型猪(PIC344)精液酸性磷酸酶(ACPase,E．C．3．1．3．2)的活力。同一浓度不同种类的修饰剂修饰酶活力降低程度不同。化学修饰剂修饰ACPase不同时间后,酶活力均有不同程度的降低,其中PMSF作用60min后酶活力仅存18％,而BrAe的修饰对ACPase的活力无明显影响。