固体表面特征对脲变α-糜蛋白酶折叠的贡献

以脲变α-糜蛋白酶(α-Chy)为模型蛋白, 用蛋白折叠液相色谱法研究了该蛋白在7种不同固体表面上的折叠及其在折叠过程中形成的中间体, 选用疏水相互作用色谱(HPHIC)固定相为吸附剂, 在动态条件下着重研究了疏水色谱固定相TSK和PEG-600表面对脲变α-Chy复性效率的贡献. 用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱对3.0 mol•L^－1脲变α-Chy, 在经 HPHIC柱复性并同时分离的收集组分进行确认后, 仅有一种稳定的脲变α-Chy折叠中间体. 发现PEG-600固定相表面较TSK固定相对α-Chy复性效果好. 证实了疏水性强度及固体表面配基的结构对蛋白折叠起着关键性的作用.     

用疏水色谱对还原型胍变性牛胰岛素的折叠特性研究

用疏水相互色谱(HPHIC)对还原胍变性牛胰岛素在疏水界面上的折叠与复性进行了研究.结果表明,采用普通流动相时,对还原胍变胰岛素的复性效果较差,而采用氧化型流动相可使其复性效率提高到66%,并用反相色谱(RPLC)、紫外吸收光谱、荧光光谱及MALDI-TOF对其复性效果进行了验证.同时与体积排阻色谱(SEC)和稀释法对还原胍变胰岛素的复性结果进行了比较.结果表明,SEC根本无法使还原胍变胰岛素复性,而稀释法的复性效率仅有2%.这进一步表明HPHIC是变性蛋白复性的有效工具,变性蛋白在疏水界面折叠过程中,蛋白质与固定相之间的疏水相互作用对蛋白折叠起着关键性的作用,是蛋白折叠的主要驱动力.     

胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现,两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时,得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现，两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时，得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

四氢糠醇对α-胰凝乳蛋白酶在液相色谱中复性效率的影响

用高效疏水相互作用色谱（HPHIC）研究了将四氢糠醇加入盐酸胍（GuHCl)变性剂中或将四氢糠醇键合至硅胶基质时，对α－胰凝乳蛋白酶（α-Chy)复性效率的影响情况，并以α－Chy的生物活性回收率对结果进行了表征。用尺寸排阻色谱（SEG）与HPHIC的实验结果进行了比较，结果表明，四氢糠醇在变性剂中和键合至硅胶上时，均可提高α－Chy的复性效率，但提高的程度不同。四氢糠醇在溶液中或在HPHIC固定相表面时具有辅助α－Chy进行复性作用的机理可能是由于四氢糠醇与α－Chy形成了复合物的形式。实验中还对GuHCl中加入的四氢糠醇量进行了优化。     

用疏水色谱复性并同时纯化蛋白质的机理及其应用

变性蛋白表面的疏水氨基酸残基有与疏水色谱固定相(STHIC)颗粒相互作用的倾向, 两者之间的疏水相互作用能够抑制变性蛋白分子间的相互聚集. 同时疏水色谱固定相还能在分子水平上给变性蛋白分子提供足够高的能量, 使其瞬时脱水并折叠成其天然构象或不同的折叠中间体. 变性蛋白在疏水界面上的折叠不仅取决于其氨基酸之间的特异性相互作用及疏水色谱固定相的结构, 而且还取决于固定相和流动相之间的协同作用. 同时, 还提出了高效疏水相互色谱(HPHIC)进行蛋白折叠的机理及其进行蛋白折叠时能实现质量控制的原理. 在适当的色谱条件下, HPHIC 可使几种变性蛋白一步实现复性及同时纯化. 此外, 还设计制造出了直径比柱长大得多的实验室型和制备型“变性蛋白复性及同时纯化装置, USRPP”, 该“装置”具有完全除去变性剂、使蛋白质复性, 与杂蛋白分离及易于回收变性剂的“一石四鸟”功能. 该“装置”对变性蛋白的复性和纯化效率与通常使用的长柱相当. 在制备规模情况下, 该“装置”可以在低压梯度条件下简便、快速、而经济地应用于重组蛋白药物的制备. 文中以重组人干扰素-γ为例, 说明了制备型“装置”在其复性及同时纯化生产工艺中的应用.     

高效疏水作用色谱法对还原变性溶菌酶的折叠研究

首次用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)研究了还原变性溶菌酶(Lys)的复性。对还原变性Lys在3种疏水性不同的色谱柱上的复性情况进行了考察,发现还原变性Lys在疏水性最弱的XDM-GM1型色谱柱上的复性效率最高,当Lys质量浓度为2.0 g/L时,其复性效率可达到94.6%。     

采用不同疏水相互作用色谱柱从包涵体中快速制备重组人干细胞因子

为了提高重组人干细胞因子(rhSCF)的复性效率,改进了高效疏水相互作用色谱(HPHIC)纯化和复性rhSCF的方法。首先将目标蛋白溶解于8.0 mol/L脲中,然后将rhSCF包涵体的提取液直接进样到不同规格的HPHIC柱进行纯化和复性。优化了固定相配基结构和流动相组成等实验条件,结果表明,本方法可以快速地获得高质量回收率和高生物活性的rhSCF,rhSCF在40 min内即可完成复性与纯化,目标蛋白的纯度在95.5%以上,质量回收率高于49.6%。通过体积排阻色谱和基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的分析,确认rhSCF以单体存在。结果进一步证明HPHIC法是同时复性和纯化重组蛋白的有效工具。     

多方法组合分析脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠和重折叠过程的构象转化

以变性和非变性电泳、体积排阻色谱、内源荧光发射光谱、荧光相图、荧光猝灭以及活性测定等组合分析方法,研究了脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程。结果表明,在脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中,芽孢杆菌α-淀粉酶分子始终以单分子形式存在,不会形成分子间的聚集体或聚集体沉淀。当变性液或复性液中脲浓度约为4.0mol/L时,芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中均出现一个部分折叠中间体,两个过程均符合"三态模型"。脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子重折叠过程的复性曲线几乎与芽孢杆菌α-淀粉酶分子去折叠过程的残余活性率曲线重合。通过这些结果,并结合盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程,推断脲和盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程分别是相互可逆的。     

用高效疏水色谱法对多种脲变α—淀粉酶折叠中间体的研究

用高效疏水色谱法对用脲变性的α－淀粉酶的体外折叠中间体进行了分离，发现脲变α－淀粉酶折叠至少有１９个中间体，而且，这些中间体在色谱流出液中可稳定一周。这一结论已由电泳、离子交换色谱和体积排阻色谱法证实。此外，还用紫外吸收光谱和荧光发射光谱研究了这些折叠中间体与天然α－淀粉酶构象之间的差异。     

用高效疏水色谱法对多种脲变α-淀粉酶折叠中间体的研究

用高效疏水色谱法对用脲变性的α-淀粉酶的体外折叠中间体进行了分离，发现脲变α-淀粉酶折叠至少有19个中间体，而且，这些中间体在色谱流出液中可稳定一周．这一结论已由电泳、离子交换色谱和体积排阻色谱法证实．此外，还用紫外吸收光谱和荧光发射光谱研究了这些折叠中间体与天然α-淀粉酶构象之间的差异．     

高效疏水相互作用色谱法复性与同时纯化重组人Flt3配体的包涵体蛋白质

Flt3配体(FL)是一类具有促进早期造血功能的细胞因子,在促进造血细胞生长发育及造血动员方面具有重要的临床应用价值。为了用基因工程方法获得大量用于临床和研究的重组人FL(rhFL)蛋白质,本文对在大肠杆菌(E. coli)中表达得到的Flt3配体的包涵体进行回收、洗涤,溶解于8 mol/L脲后在高效疏水相互作用色谱(HPHIC)柱上进行rhFL包涵体的复性与同时纯化,并对其保留特征和复性规律进行了研究。结果表明,在连续进样、变性蛋白质质量浓度为8.51 g/L、固定相选用端基为PEG800、流动相添加4 mol/L脲、1.8 mmol/L 还原型谷胱甘肽(GSH)和0.3 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSH)、pH 7.0的优化条件下,复性与同时纯化rhFL包涵体的质量回收率为36.9%,纯度达94.5%以上。本文仅用一步HPHIC法成功地复性与同时纯化了rhFL蛋白质,为获得高活性的rhFL产品奠定了一定的工作基础。     

蛋白折叠液相色谱法复性和纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞集落刺激因子

用蛋白折叠液相色谱法(PFLC)对大肠杆菌表达的包涵体形式的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化。用Cu2+-亚氨基二乙酸（IDA） Sepharose作为固定化金属离子亲和色谱的固定相。在低浓度脲存在下,以咪唑为洗脱剂,采用线性梯度洗脱rhG-CSF。该法仅通过一步PFLC分离,减少了复性过程中rhG-CSF的聚集,复性后的rhG-CSF的比活性为1.8×108 IU/mg,纯度为97%,质量回收率为32%。     

蛋白质在固定Zn2+金属螯合亲和色谱中的变性热力学

在15~85℃宽温度范围,研究了蛋白质在固定Zn2 金属螯合色谱系统中的热行为和变性热力学。实验结果表明,蛋白质在色谱过程都有一个固定的热转变温度:核糖核酸酶(RNase)、α-胰凝乳蛋白酶原A(α-Chy)的热转变温度约为55℃,细胞色素C(Cyt-C)和溶菌酶(Lys)约为65℃;,热转变温度的出现标志蛋白质构象发生变化;利用Van′tHoff作图测定了蛋白质在色谱系统热变性时的标准焓变ΔH°和标准熵变ΔS°,提出用标准熵变ΔS°和自由能变ΔG°判断蛋白质构象变化;利用ΔH°-ΔS°的线性关系估算了蛋白质热变性时的补偿温度,鉴定了蛋白质各变体在金属螯合色谱中保留机理的同一性,RNase、Cyt-C、Lys和α-Chy的补偿温度分别为55℃、65.8℃、65.2℃和54.8℃;根据蛋白质热变性时的补偿温度和构象变化熵变Δ(ΔS°)的大小,讨论了蛋白质在阳离子交换色谱和固定Zn的金属螯合色谱体系中的热稳定性。实验证明,在IDA裸柱引入Zn2 后蛋白质在色谱系统中的热稳定性减小,平均补偿温度从65.3℃降低到59.7℃,而构象变化熵变的绝对值大幅度升高。     

MMP-12 蛋白包涵体复性时折叠状态核磁共振图谱与荧光光谱研究

MMP-12 是癌症治疗药物靶标. 为了更好研制新药, 需要大量制备MMP-12, 但MMP-12 在大肠杆菌中以包涵体形式表达. 因此如何优化蛋白复性过程是大量获取MMP-12 蛋白的关键. 采用核磁共振、稳态荧光法、外源性ANS (8-anilinol-naphthalenesulfonic acid)荧光探针三种方法监控MMP-12 变性蛋白的再折叠过程, 以探究其复性折叠机制. 研究发现MMP-12 再折叠中点值与对应的尿素浓度几乎相等(C_m≈4, mid-point of transition). 不同尿素浓度中MMP-12 的二维¹H-¹⁵N HSQC (heteronuclear single quantum correlation)谱图显示, 尿素浓度从4 mol/L 降低到3 mol/L 是MMP-12 蛋白复性折叠的关键步骤. 据此我们将MMP-12 蛋白复性从常规的梯度透析复性方法改进成等容透析复性法(即确保尿素从4 mol/L 到3 mol/L 的浓度变化缓慢), 实现复性收率提高一倍.     

高效疏水作用色谱填料的合成及其在重组人干扰素纯化中的应用

高效疏水作用色谱（HPHIC）是利用不同蛋白质表面疏水区域与填料之间具有不同疏水作用进行分离的．由于HPHIC采用盐水体系作为流动相，配体采用极性的有机基团，使蛋白质可以在十分温和的条件下进行分离，且保持其生物活性基本不变[1，2]．自80年代中期以来，HPHIC在蛋白质的分离纯化上得到了广泛的应用．在90年代初期，随着基因工程技术的发展，HPHIC同时也被应用到基因工程的下游纯化技术上[3，4]．本文中我们合成了一OCH2CH3为端基的填料，检验了该填料的分离效果，并利用该填料对酵母菌表达的人αA-干扰素、大肠杆菌（E．col…     

硅藻土载负葫芦[7]脲气相色谱固定相的制备及其性能评价

在酸性条件下,将自制的葫芦[7]脲均匀地涂覆到102白色硅藻土担体上,制得葫芦[7]脲气相色谱固定相。 采用红外光谱、质谱、元素分析和热重分析表征了葫芦[7]脲在载体表面的结构。 利用相关探针测定了新固定相的麦氏常数,表征了其基本色谱性能。 考察了葫芦[7]脲气相色谱固定相填充柱对芳香烃、卤代烃、醇、酮、酯及硅氧烷的分离能力。 结果表明,葫芦[7]脲固定相热稳定性高,柱色谱性能稳定,对较广泛的化合物尤其对高沸点的酯类及硅氧烷类化合物显示出良好的色谱分离能力(7 min内分离),作为气相色谱固定相有较好的应用前景。 初步讨论了葫芦[7]脲固定相对上述化合物的分离机理。     

蝎子毒素多肽WaTx的高效化学合成及氧化折叠研究

相比于1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)、1-羟基苯并三唑(HOBt)等传统偶联试剂, 新型多肽偶联试剂2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)具有安全、偶联效率高、消旋率低等优势, 在多肽合成特别是微波固相合成中得到广泛应用. 但是, 不同反应温度(例如28、50和75 ℃)对N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)/Oxyma的偶联效率以及对甲硫氨酸(Met)等易氧化氨基酸的影响尚有待研究. 瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1)通道在感受温度、听觉和炎症痛中发挥重要作用. 蝎子毒素多肽芥末受体毒素(WaTx)是一种新型、非共价结合的TRPA1特异性激动剂. 本研究利用6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU)/N,N'-二异丙基乙胺(DIEA)和DIC/Oxyma缩合体系, 首次探索了不同温度下线性WaTx的合成效率以及Met残基的氧化情况. 通过一次氧化折叠和两次氧化折叠策略, 实现了WaTx的体外快速复性折叠, 利用圆二色谱和钙荧光检测等技术评价WaTx的结构和活性. 本研究建立了WaTx的温和、高效合成以及复性折叠方法, 为固相多肽合成特别是手动固相合成WaTx等含有易氧化基团的二硫键构象锁定多肽提供了重要参考.     

盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子重折叠过程及其各稳定构象态的分布和过渡

采用变性和非变性电泳、 高效凝胶排阻色谱、 内源荧光发射光谱和荧光相图以及生物活性测定等方法, 研究了盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程及此过程中卵清溶菌酶分子各稳定构象态的分布和过渡. 结果表明, 当复性液中盐酸胍浓度分别约为5.0和2.4 mol/L时, 变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程各存在1个稳定折叠中间态, 重折叠过程符合"四态模型". 在卵清溶菌酶分子四态重折叠过程基础上, 结合盐酸胍与卵清溶菌酶分子之间的缔合-解离平衡, 给出了一个定量描述变性剂诱导的蛋白质分子复性过程中蛋白质分子复性率随溶液中变性剂浓度变化的方程. 该方程包含2个特征折叠参数, 一个是蛋白质分子从一个稳定构象态过渡到另一个稳定构象态的热力学过渡平衡常数k; 另一个是在此过程中平均每个蛋白质分子所结合的变性剂分子数目m. 通过这2个特征折叠参数能够定量描述盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶完全去折叠态、 折叠中间态和天然态分子随复性液中盐酸胍浓度变化的分布和过渡情况.     

重组人干扰素-γ的制备与鉴定

用聚乙二醇200疏水相互作用色谱固定相(PEG200-STHIC)分别在色谱柱和色谱饼上完成了一步复性并同时纯化来源于大肠杆菌(E.coli)表达的重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)。为了能使色谱分离方法用于不同来源的rhIFN-γ的纯化,对rhIFN-γ在反相色谱、离子交换色谱、固定化镍离子亲和色谱上的保留行为也进行了研究。色谱柱纯化的rhIFN-γ收集液经排阻色谱除盐和冷冻干燥得到rhIFN-γ干粉。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对rhIFN-γ干粉进行了测定,rhIFN-γ单体的相对分子质量为17184.0,二聚体的相对分子质量为34204.4。用细胞病变抑制法(CPEI)测定rhIFN-γ干粉的比活性为9.5×108 IU/mg。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定rhIFN-γ干粉的纯度高于95%。用色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ的质量回收率达到93.7%,纯度高于95%,比活性为4.3×107 IU/mg。结果表明,采用PEG200-STHIC色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ是一种十分高效的方法。