有机材料的双光子吸收物理特性及其应用

近年来，具有大双光子吸收截面的有机材料的物理性质及其应用的研究成为令人关注的重要研究课题。文章综述了有机材料的双光子吸收过程，物理特性以及其实验测试和研究方法，评述了有机材料的双光子吸收效应的应用，包括上转换散射，光学限幅，双光子荧光显微成像、三维光信息存储和光学微加工等。     

多光子成像技术的生物医学应用新进展

多光子成像技术由于具有低侵入性、强穿透力、高空间分辨率等优点,自问世以来便成为生物医学研究的有力工具,在癌症病理、神经疾病及脑功能成像等方面取得了一系列较好的研究成果.目前,应用较为广泛的多光子成像技术是双光子激发荧光显微成像技术,其在生物医学应用中具有较大的发展潜力.本文详细阐述了多光子成像技术在多色成像、功能成像及成像深度等方面的生物医学应用新进展,包括多色双光子激发荧光显微成像、双光子激发荧光寿命显微成像、双光子光纤内窥成像和三光子显微成像技术,并简要介绍这几种多光子成像技术的原理与特性,最后展望其未来发展前景.     

多光子皮肤成像技术及其应用

多光子成像技术是一种层析能力好、信噪比高的新型光学成像技术。在皮肤光学三维检测中,多光子技术已经应用于无创在体成像,且已得到产业化开发。本文将首先介绍多光子皮肤检测系统的若干核心技术,即双光子自发荧光技术、二次谐波成像技术、荧光寿命成像技术、相干反斯托克斯-拉曼成像技术等,然后简要介绍多光子成像系统在皮肤疾病成像检测上的应用,最后分析该系统的优势和未来可能的发展趋势。     

基于激光共焦扫描术的亚心形扁藻显微图像与光谱

采用激光共聚焦扫描显微技术,针对亚心形扁藻开展了研究.从获得的488 nm Ar+激光单光子激发的亚心形扁藻自体荧光光谱与图像,可知细胞内有一杯状叶绿体物质,其荧光峰值为682 nm,对应叶绿体发出的红色荧光.在单通道模式下,获得800 nm fs激光双光子激发的扁藻自体荧光光谱与图像,可知每个杯状叶绿体的内部有一个自体荧光更强的圆形物质.在双通道模式下,可分别获得小圆形物质的自体荧光图像,杯状叶绿体自体荧光图像,以及两个通道图像的叠加.进一步获得了双光子藻细胞荧光图的6个主要的荧光峰.采用单光子激光激发可获得亚心形扁藻叶绿体自体荧光图像及其荧光光谱,而双光子激光激发荧光光谱的多通道以及Lambda模式下采集光谱信号与图像,不仅可观察到亚心形扁藻的内部形态结构,还可能从双光子激发荧光图中研究分析亚心形扁藻生化物质的存在,灵敏度较单光子激发高.激光扫描共聚焦显微技术,特别是双光子荧光与图像技术可为海藻的检测与研究提供一种快速、实时、有效、简便的方法.     

基于环形光瞳提高荧光辐射差分超分辨显微镜的成像分辨率

荧光辐射差分(FED)显微术利用实心光斑扫描的一幅共聚焦图像减去空心光斑扫描的负共聚焦图像,实现了超分辨成像。使用简单的环形光瞳滤波器提高了无变形FED的成像分辨率。在空心焦斑光路上使用合适的环形光瞳滤波器,压缩空心焦斑的尺寸;同时,在实心焦斑的光路上允许使用更高数值孔径的孔径光阑,获得更小的、与空心焦斑相匹配的实心光斑分布:两方面作用下,提高了FED的空间分辨率。     

基于线扫描成像的光片荧光显微镜

设计了一种基于线扫描成像(LSI)的光片荧光显微镜(LSFM),旨在通过抑制样本散射达到提高成像质量的目的 .该显微镜将数字扫描光片荧光显微镜(DSLM)与LSI两种方法结合,以前者为基础,在探测光路上增加了一个用于解扫描的扫描振镜.在控制过程中,将照明光路的扫描振镜与解扫描振镜同步,使得均匀运动的图像在相机前固定于同一位置,从而实现了LSI.在系统中,为了便于与传统方法对比,线阵探测器通过面阵相机模拟实现.另外,与常规的LSFM相比,改进后的系统,在高散射荧光微球样品和斑马鱼心脏样品的成像实验中,更有效地抑制了样本散射.因此,验证该方法具有可行性.     

随机扫描多光子荧光显微成像系统

多光子荧光显微成像是生物学研究的有力手段,但目前的成像速度难以满足神经成像中快事件检测的需要。针对这一问题,提出了一套随机扫描快速多光子荧光显微成像系统。系统采用二维声光偏转器快速扫描飞秒激发光束,能够以每点10μs的速度对特定的感兴趣区域进行跳跃式扫描,即随机扫描,使得有效的扫描速度大为提高。引入单棱镜补偿方法解决应用声光偏转器带来的色散问题。以170 nm荧光小球为样品,测得系统的横向分辨力为0.3μm,纵向分辨力为1.3μm。给出了随机扫描系统和商品化多光子荧光显微镜对同一个荧光细胞的成像结果,证明了新系统的成像能力。     

多变视场的多焦点多光子激发荧光显微技术

发展了一种新型的多焦点多光子激发荧光显微技术,通过软件控制空间光调制器,在所需要的成像区域产生相应的激发光点阵,通过扫描入射角实现激发点阵快速并行扫描激发,通过CCD并行记录所产生的荧光信号,获得任意视场图像。分别实现了10×10和50×50点阵激发下的全视场双光子荧光图像,并且实现了同时多个区域寻址的多焦点激发成像。对比其他多焦点显微技术,该技术具有明显的灵活性,不但保持了多焦点激发的快速成像的优点,而且还增加了任意数量成像区域同时寻址和阵列点密度变化,所有这些变化只需要通过软件加载相应的相位图案给空间光调制器,而不需要任何硬件更改。     

小鼠荧光层析成像系统及数据提取扩展方法

基于电子倍增电荷耦合器件探测器搭建了面向小鼠活体非接触式测量的荧光扩散光层析成像系统,为了避免复杂的焦点矫正计算并降低逆问题的病态性,提出一种新的电荷耦合器件平板探测器信息提取及扩展方法,并根据信息提取方法发展了非接触式荧光扩散光层析成像图像重建算法.通过大量仿体荧光扩散光层析成像实验,证明当提取的信息对应于圆柱域投影的1/2、且将信息提取域分解为3个子域时重建可获得最好的效果.制备了皮下植入荧光目标体的活体小鼠进行荧光扩散光层析成像实验,与显微CT成像结果的对比表明:搭建的系统结合所发展的图像重建算法能够较好地重建出活体小鼠内荧光目标体的位置和浓度,有望应用到小鼠肿瘤模型的荧光层析成像中.     

基于阈值分割的并行压缩鬼成像方法

为了提高鬼成像的速度,提出了基于阈值分割的并行压缩差分鬼成像方法。首先通过设置合理的阈值筛选出涨落较为明显的数据进行采样;然后再通过并行分块降低图像维度,提高整体运算速度;最后通过压缩感知重构算法重构图像。通过对图"BUAA"的半物理仿真以及透射物体"光"的实验结果表明,与普通的二阶赝热光关联成像相比,该方法能以更少的采样次数和运行时间重构图像,可提升成像信噪比。     

基于电动可调焦透镜的大范围快速光片显微成像

搭建了一种基于电动可调焦透镜(electrically tunable lens)的大范围快速光片荧光显微成像系统.通过引入电动可调焦透镜与一维振镜以实现成像物平面和光片位置的快速移动,再结合高速s CMOS完成快速光片荧光显微成像.另外实验中通过改善光路与提升动态成像质量,实现了大范围扫描并减少了伪像.最终对成像性能进行测试,本系统的纵向分辨率和横向分辨率分别达到约5.5μm和约0.7μm,单幅图像稳定成像的速度约为275 frames/s,成像深度可超过138μm,能满足对具有一定尺寸的生物样本进行实时清晰成像的需求.     

Out-of-focus fluorescence collection in two-photon microscopy of scattering media

Imaging depth in two-photon microscopy is ultimately limited by the out-of-focus fluorescence background which is collected indistinctly with the useful in-focus signal in scattering samples. We report on a complete Monte Carlo analysis of the collection process in two-photon imaging of turbid media. Epifluorescence collection efficiency of the microscope is shown to vary significantly from point to point inside the scattering medium, to the detriment of the in-focus signal and in favor to the background, lowering the signal-to-background ratio in the image. Moreover we found that this ratio is almost independent of the collecting path field of view for situations where the background overcomes the signal. Assuming that the out-of-focus background can be subtracted to the image, the signal-to-noise ratio in two-photon microscopy is forecast to benefit from enlarging the collection field of view, with a gain roughly proportional to this enlargement for deep imaging. Asymptotic behaviors of the Monte Carlo simulations are quantitatively interpreted from ballistic and diffusive approximations.     

基于多角度无透镜傅里叶变换数字全息的散斑噪声抑制成像研究

在数字全息成像中,散斑噪声严重影响了再现像的信噪比和成像分辨率,因此为了提高数字全息成像质量,迫切需要抑制再现像的散斑噪声.分析并给出了矩形散射光斑的强度协方差,定量计算了特定实验条件下产生退相关散斑图样的最小角度差.结合透镜的性质设计并搭建了多角度无透镜傅里叶变换数字全息成像系统,利用光纤端面在透镜焦平面的二维机械移动代替传统反射镜的旋转,使照明光束在不改变照明位置和大小的同时,可任意改变光束方向.移动光纤端面使多角度照明满足最小角度差,获取了81幅数字全息图.利用单次快速傅里叶逆变换实现数值再现,对多幅再现像的强度像求平均,实验结果表明散斑对比度降低为单幅再现像的14.6%,使图像信噪比提高了6.9倍.该抑制散斑的多角度数字全息成像方法有效的抑制了散斑噪声,且成像光路结构简单,可操作性强.     

多谱段短波红外小鼠静脉荧光观测成像研究

短波红外(short-wave infrared,SWIR)一般指900～1700 nm的光波段,是肉眼不可见的光波段,这种波段目前主流的探测器以InGaAs为主,主要用于军事、生物以及材料光谱分析等领域.短波红外荧光成像以其对生物组织光学损伤小、成像深度大、成像信噪比高、空间和时间成像分辨率高等特点,使得基于InGa...     

基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微

在传统共聚焦显微技术的基础上,图像扫描显微技术使用面阵探测器来代替单点探测器,结合虚拟数字针孔并利用像素重定位和解卷积图像重构算法将传统宽场显微镜的分辨率提高一倍,实现了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐点扫描的方式,三维成像速度相对较慢,限制了其在活体样品成像中的应用.为了进一步提高图像扫描显微术的成像速度,本文提出了一种基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微成像方法和系统.在照明光路中,利用高速数字微镜器件产生周期分布的聚焦点阵对样品进行并行激发和快速二维扫描;在探测光路中,利用双螺旋相位片将激发点荧光信号的强度分布转换为双螺旋的形式;最终,利用后期数字重聚焦处理,从单次样品扫描数据中重构出多个样品层的超分辨宽场图像.在此基础上,利用搭建的系统分别对纤维状肌动蛋白和海拉细胞线粒体进行成像实验,证明了该方法的超分辨能力和快速三维成像能力.     

基于压缩感知的差分关联成像方案研究

关联成像可提供一种运用常规手段难以获得清晰图像的方法, 能够解决一些常规成像技术不易解决的问题, 是近些年来量子光学领域的前沿和热点之一.本文提出一种基于压缩感知的差分关联成像方案(简称, 差分压缩关联成像方案), 将高斯分布的热光源强度分布作为压缩感知的测量矩阵, 差分物体信息作为被成像物体信息, 利用差分关联成像方案的高成像信噪比和压缩感知技术的低采样次数, 通过正交匹配追踪算法, 高质量地恢复出物体信息. 并以二灰度“双缝”、“NUPT”, 多灰度Lena图和Boats图为例, 数值仿真差分压缩关联成像过程; 同时将本方案350次测量的结果与差分关联成像方案30000次测量的结果进行对比, 研究结果表明针对不同的被成像物体(二灰度“双缝”、“NUPT”, 以及多灰度Lena图和Boats图), 10次成像的均方误差平均值分别降低了97.7%, 93.9%, 92.5%和71.4%; 与压缩鬼成像方案相比, 同样测量次数条件下均方误差值对于二灰度双缝和多灰度Lena图、Boats图等目标物 体分别有50.4%, 72.9%和66.8%的降低. 差分压缩关联成像方案极大地提高了成像信噪比, 降低了成像时间. 关键词： 关联成像 差分 压缩感知 均方误差     

Photobleaching and stabilization of. fluorophores used for single-molecule analysis. with one- and two-photon excitation

Fluorescence spectroscopic measurements at the single-molecule level usually require large absorption cross sections and fluorescence quantum yields for the dyes under study. In addition to these parameters, the collectable number of fluorescence photons and, thus, the signal-to-noise ratio of the measurement, is influenced by processes like triplet-state population and photobleaching, shifting the saturation threshold of the dye to lower excitation intensities. Confocal fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a versatile method to precisely determine photon emission rates of single molecules but also gives access to rate constants of dynamic bleaching and intersystem crossing. In recent FCS studies in solution and living cells, two-photon excitation with its inherent spatial sectioning has proven to be a very valuable alternative to minimize background and cumulative signal loss. However, there is evidence that in many dye systems, the photobleaching rates with two-photon excitation are significantly enhanced with respect to one-photon excitation at comparable photon-emission yields. The reasons have so far remained mainly speculative. In the present study, potential photobleaching pathways are investigated by adding chemical stabilizers and by working at different oxygen concentrations. The results suggest that the population of triplet states does not appear to be responsible for the limited emission rate with two-photon excitation. Rather, photobleaching pathways via the formation of radicals seem to be plausible causes for the signal limitation. Favorable conditions are discussed to maximize the overall photon-collection yield in two-photon experiments. Received: 4 July 2001 / Published online: 23 November 2001     

荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展

由于荧光寿命不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响,荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)在监测微环境变化、反映分子间相互作用方面具有高特异性、高灵敏度、可定量测量等优点,近年来已被广泛应用于生物医学等领域.然而,尽管FLIM的发明和发展已历经数十年时间,其在实际应用中仍然面临着许多挑战.例如,其成像分辨率受衍射极限限制,而其成像速度与成像质量和寿命测量精度则存在相互制约的关系.近几年来,相关硬件和软件的快速发展及其与其他光学技术的结合,极大地推动了FLIM技术及其应用的新发展.本文简要介绍了基于时域和频域的不同寿命探测方法的FLIM技术的基本原理及特点,在此基础上概述了该技术的最新研究进展,包括其成像性能的提升和在生物医学应用中的研究现状,详细阐述了近几年来研究者们通过硬件和软件算法的改进以及与自适应光学、超分辨成像技术等新型光学技术的结合来提升FLIM的成像速度、寿命测量精度、成像质量和空间分辨率等方面所做的努力,以及FLIM在生物医学基础研究、疾病诊断与治疗、纳米材料的生物医学研究等方面的应用,最后对其未来发展趋势进行了展望.     

小鼠卵母细胞染色体三维双光子荧光图像的轴向衰减

双光子荧光显微镜作为一种高分辨光学仪器,已经被广泛应用于生物样品的非侵入式三维光学成像中。相比共聚焦显微镜,双光子荧光显微镜拥有更深的探测深度。然而,即便如此,在对较厚的生物样品进行非侵入式光学三维成像时,样品的成像质量也往往会随着探测深度的增加而下降。在临床和生物学领域对研究母性遗传起重要作用的小鼠卵母细胞拥有较大的直径(80～100 μm),吸收和散射效应较为明显。本文研究小鼠卵母细胞染色体的三维双光子荧光图像随探测深度增加图像质量的衰减程度。通过对所得图像进行轴向衰减矫正,利用体积作为参数,将矫正前后小鼠卵母细胞内染色体三维双光子荧光图像进行对比。结果表明,由于吸收和散射效应,卵母细胞存在较严重的光学轴向衰减问题,因此,对用双光子荧光三维成像手段获得的小鼠卵母细胞图像进行衰减矫正是有必要的。这为进一步精确定量的研究卵母细胞内染色体的三维构像打下良好的基础。