双抗体夹心酶联免疫检测法测定蓖麻毒素

建立了双抗体夹心酶联免疫法检测蓖麻毒素的方法。优化了最佳蓖麻毒素多克隆抗体包被浓度和包被方法、蓖麻毒素单克隆抗体工作浓度、酶标记二抗体工作浓度和显色时间等实验条件。方法的线性范围在1.2~10.0μg/L之间,线性回归方程y=0.05x 0.42,相关系数为0.9962,检出限为0.2μg/L。将该方法用于检测实际水样蓖麻毒素加标样品,回收率为91.7%~104.0%;检测实际土壤加标样品,回收率为83.3%~98.0%;检测奶粉加标样品,回收率为83.3%~94.0%;检测实际血液加标样品,回收率为75.0%~82.0%。     

基于自动磁珠转运的转基因蛋白Cry1Ab检测

基于自动磁珠转运,建立了转基因蛋白Cry1Ab免疫检测的新方法.利用水热法制备了粒径约400 nm的纳米磁球,并进行电镜表征,通过溶胶法对磁球表面进行氨基修饰,采用戊二醛偶联对磁珠实现抗体包被,在核酸提取仪中进行酶联免疫反应,采用分光光度法进行检测.本方法对转基因蛋白Cry1Ab的检出限低于1 μg/L,与商品化酶联免...     

孔雀石绿单克隆抗体制备和酶联免疫检测方法的建立

针对孔雀石绿三苯环特征结构,设计合成1种高质量半抗原。通过偶联载体蛋白、动物免疫和细胞融合,制备出一株高质量的单克隆抗体MG-DA4-C7,亚类为IgG1,轻链为κ型。通过对包被原浓度、抗体浓度、二抗浓度的优化,建立了孔雀石绿间接竞争酶联免疫分析方法。方法半抑制浓度( IC50)为0.96μg/L,线性检测范围(IC20~C80)为0.1~8.1μg/L,LOD(IC10)为0.05μg/L,回归方程y=-0.3274lgx+0.4698(R2=0.9891)。本方法特异性高,与代谢物隐孔雀石绿交叉反应小于0.1％,与结晶紫、灿烂绿交叉反应率分别为18.1％和26.5％;实际样品添加回收率为87.3％~107.3％。本方法测定结果经HPLC-MS/MS方法确证,二者相关系数达0.999。本方法可用于鱼类等水产品中孔雀石绿残留的实际检测。     

酶联免疫分析法探测Cry1Ab蛋白在不同介质中的构象变化

采用酶联免疫分析（ELISA）方法,根据构象变化后的蛋白与抗体结合能力下降从而导致ELISA测定值降低的原理,探测了转cry1Ab基因水稻表达的Cry1Ab蛋白在不同溶液介质中的热致构象变化行为,以及不同有机溶剂及溶液pH值对该蛋白构象变化的影响程度。实验表明,Cry1Ab蛋白在不同条件下的构象变化程度可以灵敏地通过ELISA方法检测。在不同的介质中,CrylAb蛋白的热致构象变化程度不同。在Na2SO4介质中,该蛋白具有较高的热稳定性;SDS的存在,可以促进该蛋白的构象变化。常温下,25％（V／V）的有机溶剂乙腈、异丙醇、甲醇、乙醇均能使该蛋白的构象发生转变,其中以乙腈最为显著。醇类溶剂对Cry1Ab蛋白的构象影响程度随疏水性增大而增大;溶液pH值也对该蛋白的构象变化产生影响。pH在8-10之间,该蛋白构象能保持稳定;酸或过碱性的溶液均能使蛋白构象偏离原始状态,从而引起ELISA测定值的降低。另外,腐殖酸能在一定时间内保持Cry1Ab蛋白构象的稳定性。     

基于单克隆抗体的滴滴涕、硫丹和水胺硫磷酶联免疫检测方法研究

该研究制备了滴滴涕、硫丹和水胺硫磷的单克隆抗体.利用商业化的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体作为检测二抗,分别建立了 3种农药的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA).在最优条件下,ic-ELISA对滴滴...     

细交链格孢菌酮酸间接竞争酶联免疫检测方法及配套试剂盒的研制

建立了间接竞争酶联免疫吸附法检测食品中细交链格孢酮酸(Tenuazonic Acid,TA)残留,并研制快速检测试剂盒。采用肟化法对TA进行衍生化,活泼酯法偶联半抗原和载体蛋白得到人工抗原TAO-BSA和TAO-KLH,以TAO-KLH作为免疫原免疫雌性Balb/c小鼠制备特异性抗体。对包被浓度、包被时间、封闭液类型、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等参数进行研究,建立了TA残留间接竞争酶联免疫检测方法并进行了配套试剂盒的研制。该试剂盒半抑制浓度Ic_(50)为1.48ng/mL,检测线性范围为0.06~35.95ng/mL(R~2=0.9941);检测限为0.02ng/mL;加标样品平均回收率大于88.50%;试剂盒的批间和批内平均变异系数分别为2.84%和9.49%,与食品中常见真菌毒素交叉反应率均小于1%。     

基于磷酸化组蛋白H2AX的酶联免疫检测方法评价卷烟烟气基因毒性

基于酶联免疫原理,建立了定量测定细胞中磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)含量的新方法,并用于评价卷烟烟气的基因毒性。采用不同剂量的烟气气相物与烟气粒相物暴露于中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞),通过测定不同染毒时间下细胞中γH2AX含量水平变化,考察烟气染毒与细胞DNA损伤的剂量效应关系,以及不同烟气组分基因毒性的差异。此外,通过定量监测细胞中活性氧的变化,探讨卷烟烟气暴露诱发细胞DNA双链断裂损伤的作用机理。结果表明,随烟气暴露时间的增加,细胞中γH2AX的含量在几小时内达到峰值,然后逐渐下降;染毒浓度越高,细胞中γH2AX含量达到峰值的时间越长;随着烟气粒相物或气相物染毒浓度的增高,细胞中γH2AX含量水平呈上升趋势;烟气粒相物染毒相比烟气气相物对细胞中γH2AX含量的影响更为显著;此外,烟气成分直接染毒会引起细胞内活性氧的含量增加。细胞内活性氧的含量变化与细胞DNA双链断裂标志物γH2AX的含量变化有较强相关性,卷烟烟气中自由基成分可能是诱发细胞DNA双链断裂的原因之一。     

1-异丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体在呕吐毒素酶联免疫检测中的应用研究

合成了一种水溶性离子液体1-异丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸([i-Bmim]BF4),将其用于呕吐毒素(DON)的酶联免疫检测,结果表明,当体系中[i-Bmim]BF4的浓度为0.014 g/mL时,其定量下限为 1.41 μg/L,比不含该离子液体体系的定量下限4.57 μg/L提高了约69%;半数抑制浓度为30.20 μg/L;重复测定多次,其半数抑制浓度平均值为29.71 μg/L,相对标准偏差为3.26%;用T-2毒素代替DON进行了特异性试验,结果显示,不含离子液体体系中DON与T-2毒素、NIV的交叉反应率相对较高(分别为20.1%、14.9%),而含有0.014 g/mL该离子液体体系中DON与T-2毒素、NIV的交叉反应率分别为15.3%、10.2%.方法用于啤酒和麦芽汁中DON加标回收率的测定,实验表明,当体系中[i-Bmim]BF4浓度为0.014 g/mL,DON的加标浓度分别为50、70 mg/L时,其样品加标回收率均为98%,相对标准偏差分别为2.96%、6.02%.     

培氟沙星抗体的制备及对鸡蛋样品中培氟沙星的酶联免疫法检测

采用活泼酯法合成培氟沙星人工抗原,通过免疫新西兰大白兔获得抗体,建立了间接竞争酶联免疫法(ELISA)检测鸡蛋中培氟沙星。人工抗原经紫外光谱和红外光谱鉴定,免疫所获得抗体测得效价高达1∶51 200,继而建立了培氟沙星间接竞争ELISA,标准曲线线性相关系数为0.9920,Ic50达1.5μg/L,抗体对恩诺沙星的交叉反应率为13.89%;鸡蛋样品中分别添加不同浓度的培氟沙星和恩诺沙星,经乙腈-水溶液(体积比4∶1)提取,离心稀释后经ELISA检测,结果表明培氟沙星和恩诺沙星加标回收率为分别为90%～94.2%、84%～90.3%,相对标准偏差分别为5.2%～10.0%、6.5%～10.3%。该方法具有灵敏度高、样品前处理简单、批量检测的优点,适用于复杂食品基质中培氟沙星的定量检测。     

邻苯二胺-过氧化氢-辣根过氧化物酶酶联免疫示差脉冲伏安法测定人血清类风湿因子抗体

建立了邻苯二胺（ＯＰＤ）－Ｈ２Ｏ２－辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）酶联示差脉冲伏安分析体系并用于测定人血清中类风湿因子（ＲＦ），ＨＲＰ催化Ｈ２Ｏ２氧化ＯＰＤ所形成酶催化产物在ｐＨ２．０磷酸盐－枸橼酸缓冲溶液中于－０．１８ Ｖ左右产生一灵敏示差脉冲伏安峰，ＲＦ浓度在１．２５～２０．０ Ｕ／ｍＬ之间与峰电流呈线性关系，应用此峰检测人血清ＲＦ的检测限低至 ０．２８Ｕ／ｍＬ。该法较相同条件下ＥＬＩＳＡ显色光度测定法的灵敏度增加５倍，且受干扰较少。     

吡虫啉的酶联免疫吸附分析方法研究

通过碳二亚胺法将吡虫啉交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原,混合酸酐法将吡虫啉交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原,免疫Balb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选、克隆,得到抗吡虫啉单克隆抗体,抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体效价达1×107,确定了吡虫啉酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的最佳工作条件,建立了定量测定吡虫啉的间接竞争ELISA方法。本方法的IC50为(15.12±1.28)μg/L,检出限为(1.76±0.02)μg/L。与其它吡虫啉结构类似物无交叉反应。批内相对标准偏差为4.5%;批间相对标准偏差5.1%,饮用水、重庆理工大学地下水和重庆市花溪河地表水平均添加回收率分别为102%,97%和85%。本研究建立了一种快速检测环境水中吡虫啉残留的方法。     

传统电化学酶联免疫分析方法中第二抗体标记方法的改进（ⅩⅣ）

免疫传感分析是利用抗原-抗体特异性反应来测定痕量物质的一种高灵敏度、高选择性的方法,该方法的提出和发展,不仅推动了血清学的应用,而且也有助于从理论上研究抗原-抗体的关系及其本质。在电化学免疫分析中,背景信号的减少、响应信号的增大是构建性能优良的传感器较为关键的步骤。对于2价或2价以上的抗原的检测,双抗体夹心免疫分析法是最常用的方法。其中,第二抗体的标记是夹心免疫分析法的关键所在。     

酶联免疫吸附分析法检测花生过敏原的研究

本文利用自己研制的花生过敏原免疫新西兰大耳兔,获得效价为200 000的抗花生过敏原特异性抗体,建立了花生过敏原蛋白的间接竞争酶联免疫(ELISA)检测方法.结果表明:花生抗原在0.01～100 ng/mL范围内具有较好的线性关系,其竞争标准曲线为v=-0.1212x+0.9285(r=0.9819),IC50为34....     

酶联放大镧系螯合物发光法─辣根过氧化物酶(HRP)－铽－对羟基苯甲酸体系的研究及用于HRP和结核抗体的分析

酶联放大镧系螯合物发光法──辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）－铽－对羟基苯甲酸体系的研究及用于ＨＲＰ和结核抗体的分析谢剑炜,鄢远,彭学军,许金钩,陈国珍（厦门大学化学系、现代分析化学研究所,厦门,３６１００５）关键词酶联放大镧系螯合物发光法,辣根过氧化物酶,...     

转基因作物中CaMV 35S序列信号双重放大的电化学基因传感方法

该文设计并制备了一种针对转基因花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子检测的新型电化学基因传感器.首先制备了血红素功能化的还原氧化石墨烯(Hemin－rGO),并将其修饰于玻碳电极(GCE)表面,再通过电沉积金纳米粒子(AuNP)固定巯基化的DNA捕获探针.通过设计的夹心型传感策略,当目标序列存在时,辅助DNA通...     

硝基磺酚S作为酶联免疫分析中辣根过氧化物酶测定底物的研究

提出一种新的ＨＲＰ底物－硝基磺酚Ｓ,初步探讨了在ＨＲＰ催化下被过氧化氢氧化的机制,以硝基磺酚Ｓ为底物测定了酶促反应动力学常数Ｋｍ和Ｋｓ分别为４．５１×１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ和２８．１ｍｏｌ／Ｌ·ｓ＾－１。分别用于酶联免疫显色光度法和伏安酶联免疫分析法测定了ＩｇＧ－ＨＲＰ,其所能测定的最高稀释比分别为１：１．６×１０＾５和１：４．８×１０＾５。     

局域表面等离子体共振酶联免疫法的显色方法及检测应用

随着现场实时快速检测技术的需求和发展,贵金属纳米颗粒由于具有独特的局域表面等离子体共振(LSPR)光学性能和优点(高稳定性、易于合成、易于表面修饰等),在疾病诊断、食品安全、环境质量检测领域有着广泛的应用空间.局域表面等离子体共振效应使得贵金属纳米颗粒在可见光范围内展示出丰富的色彩变化,并且这种色彩变化很容易通过改变贵...     

分子生物学手段检测转Bt基因棉花中Cry杀虫蛋白的定性和定量方法

建立了转Bt基因棉花中Cry杀虫蛋白的提取、样品前处理以及酶联免疫(ELISA)定量分析方法,并使用凝胶电泳、普通聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR等分子生物学手段对转基因棉花中的Bt基因进行定性和定量检测.所建立的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白(Cry1Ab蛋白和Cry1Ac蛋白)标准曲线线性关系良好,相关系数r2均大于0.999,相对标准偏差RSD均小于2.0%.方法简单、快速、重现性和精密度好,可为农业食品行业和环境领域科研人员提供一种简便快速地从转基因棉花中检测Bt毒蛋白的分析方法.     

基于丝网印刷工艺的安培型酶免疫传感器的研究

研究了一种一次性安培型免疫传感器,检测辣根过氧化物酶(HRP)。用丝网印刷工艺制备三电极结构的传感器,工作电极是碳电极,银电极是伪参比电极。采用电荷传递系数、评估厚膜电极的一致性。通过戊二醛交联法,把抗HRP酶抗体固定在电极表面。加入底物H2O2和电子介体邻苯二胺,分别用安培法和比色法进行检测和比较分析。安培法测定HRP的测量范围10μg/L~10 mg/L,检出限10μg/L;比色法测定范围为2~40 mg/L,检出限2 mg/L。同时分析了湿度对传感器寿命的影响。     

高效抗虫转基因烟草的研究

苏云金杆菌HD-1的杀虫蛋白基因经5′端改造,3′端进行4种不同长度缺失后插入到含有双增强子的35S启动子,翻译增强子“Ω′”片段的双元载体中,借助土壤农杆菌LBA 4404将在此双元载体上的杀虫蛋白基因及新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)转入到生产品种烟草NC89的染色体上,从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用1—3龄烟青虫对这些转化植株进行大量重复虫试结果表明用4种不同长度B.t.基因转化的再生植株中都有抗虫性高的植株,其中以1.8kb的B.t.Cry IA(c)基因转化的植株杀虫效果最好,这一组转基因植株的平均杀虫率在90—100％的约占该组总虫试植株的50％。对高抗虫性植株的子一代(T1)和子二代(T2)进行遗传分析,分子生物学分析和进一步的抗虫试验表明B.t.基因已遗传到子代并初步选到了高抗虫性的转基因纯合株系D8-14和D19-8等。