微流控细胞芯片LED诱导荧光检测微系统

基于微流控细胞芯片分析技术和微机电系统(MEMS)加工技术, 设计制作了阵列式微流控细胞检测芯片, 采用自组装的顶窗型光电倍增管(PMT)和信号采集电路采集芯片微管道内流动细胞的荧光信号, 构建了一种针对低浓度细胞悬浮液的微流控细胞芯片发光二极管(LED)诱导荧光的快速检测微系统, 实现了对低浓度(≤40 Cell/mL)荧光标记的HepG2肝癌细胞悬浮液样本的定量计数和测试, 而且在血液细胞共存的条件下, 仍可以有效地对血液中少量HepG2肝癌细胞进行荧光计数和测试. 整个系统结构简单, 操作方便且检测灵敏度较高.     

数字PCR技术的发展及应用

数字PCR(Digital PCR, dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比,数字PCR 技术不依赖于标准曲线,具有更高灵敏度、准确度及高耐受性,可实现对样品的绝对定量分析。近年来,随着微流控技术日臻成熟,基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展,在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。本文对数字PCR的原理、技术发展和应用进行了概述。     

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统

集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统将核酸提取、PCR扩增与实时荧光检测进行整合,在同一块微流控芯片上实现了核酸分析过程的全自动和全封闭,具有试剂用量少、分析速度快、操作简便等优点。本研究采用微机械加工技术制作集成核酸提取微流控芯片的阳极模,使用组合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片,与玻璃基底通过等离子体键合封装成集成核酸提取芯片。构建了由微流体速度可调节(0~10 mL/min)的驱动控制装置、温控精度可达0.1℃的TEC温控平台、CCD检测功能模块等组成的微全分析系统。以人类血液裂解液为样品,采用硅胶膜进行芯片上核酸提取。系统根据设置好的时序自动执行,以2 mL/min的流体驱动速度完成20μL裂解液上样、清洗;以1 mL/min的流体驱动速度完成DNA洗脱,抽取PCR试剂与之混合注入到反应腔。提取的基因组DNA以链上内参基因GAPDH为检测对象,并以传统手工提取为对照,在该系统平台上进行PCR扩增和熔解曲线分析实验。片上PCR扩增结果显示,扩增曲线明显,Ct值分别为25.3和26.9。扩增产物进行熔解曲线分析得到的熔解温度一致,均为89.9℃。结果表明,此系统能够自动化、全封闭的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR扩增与实时定量分析。     

激光技术在聚合酶链式反应微流控芯片中的应用

评述了激光技术在聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)微流控芯片领域中的应用进展,包括激光技术在PCR微流控芯片微加工、微流体物理参数测量、温度循环控制以及芯片上在线产物检测(包括荧光实时定量/终点和毛细管电泳检测)中的应用。最后,展望了激光技术在未来基于PCR的微全分析系统(micro-total analysis system,μTAS)中的新应用。     

一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片

构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片. 应用多层软光刻技术, 以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料, 盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片. 芯片的大小与载玻片相当, 可同时检测4个样品, 每个样品通入芯片后平均分配到640个反应小室, 每个小室的体积为6 nL. 以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA为样品检测了该芯片的可行性. 将样品稀释数倍后通入芯片, 核酸分子随机分布在640个小室中并扩增. 核酸分子在芯片中的分布符合泊松分布原理, 当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于0.5个/小室时, 则每个反应小室包含0个或1个分子. 经过PCR扩增后, 有模板分子的小室检测结果为阳性反应, 而无模板分子的小室为阴性反应, 最后通过计数阳性反应室的个数, 可绝对定量原始待测样品中的目标DNA分子拷贝数. 实验结果表明, 该数字 PCR芯片可实现DNA单分子反应和核酸绝对定量, 具有成本低、 灵敏度高、 节省时间和试剂以及操作简单等优点, 为数字PCR方法在普通实验室的应用提供了一种新途径, 可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、 单细胞分析、 产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究.     

微流控芯片上大肠杆菌的电化学阻抗检测方法研究

基于细菌悬浮液的阻抗特性和微流控芯片电化学阻抗检测技术,采用所构建的微流控芯片电化学阻抗分析系统,以大肠杆菌为样本,优化了扰动振幅、缓冲溶液电导率、扫描频率和新制大肠杆菌标本静置时间等参数,对大肠杆菌标本、大肠杆菌标准合成样本进行电化学阻抗检测,建立了一种大肠杆菌快速定量检测方法.在扰动振幅500 mV、缓冲溶液电导率...     

微流控芯片上同工酶的孵育及活性检测

建立了一种在微流控芯片上进行同工酶孵育及活性检测的方法. 该方法在集成温控装置的微流控芯片上实现对同工酶与辅酶反应进程的控制, 完成同工酶的进样、孵育反应、电泳分离和活性检测的实验步骤. 建立了基于微流控芯片的同工酶荧光检测系统, 使用360 nm光源激发辅酶产生荧光, 在460 nm处选择性采集荧光信号. 在微流控芯片上实现了同工酶样品的快速活性检测, 酶活性检测限达到0.5 U/L.     

微流控芯片荧光检测系统的研究进展北大核心CSCD

微流控芯片又称芯片实验室,具有检测高效、消耗试剂少、高通量、微型化和集成化等特点,许多检测方式(如光学检测、电化学检测)已经集成于微流控芯片上,而荧光检测是微流控芯片检测技术的常见手段之一。为此,在介绍了荧光检测技术的基本原理和光路结构的基础上,从激发光源、光传辅助手段和检测器等方面综述了微流控芯片荧光检测系统的研究进展,并对其发展进行了展望(引用文献55篇)。     

简易型微流控芯片捕获循环肿瘤细胞的研究

本研究以循环肿瘤细胞(乳腺肿瘤细胞)为研究对象,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)、双面粘性薄膜(DSA)、玻片为原材料,采用激光雕刻技术制作微流控芯片,结合巯基-马来酰亚胺基团硅烷化偶联法和免疫荧光技术进行芯片内捕获检测实验,并使用外周血肿瘤细胞来验证此微流控芯片的实用性,使用具有高速摄像功能的荧光显微镜进行镜下观察及拍摄. 成功构建了一种简易型微流控芯片系统,利用此系统可实现对乳腺肿瘤细胞(92±3)%的捕获率,对外周血肿瘤细胞(88±3)%的捕获率,而且芯片的制作工艺简单,对实验仪器要求低,1 min内即可制作完成,简化了制作过程,弥补了传统光刻工艺复杂繁琐的不足,为临床检测疾病的发生与发展提供了新的研究方向.     

微流控芯片电泳的研究进展

该文综述了微流控芯片电泳的制备、结构和应用,比较了不同材料微流控芯片电泳的制备机理、表面改性和性能特点,归纳和总结了不同结构微流控芯片电泳的进样、分离和检测系统以及不同类型微流控芯片电泳在荧光物质、金属离子、糖、药物、核酸、DNA、氨基酸、多肽和蛋白质分析中的应用,并对微流控芯片电泳的未来发展方向做了展望.     

基于微流控芯片的72重单核苷酸多态性族群推断系统的构建

建立了常染色体单核苷酸多态性（SNPs）复合检测芯片体系,用于未知个体的族群来源推断。基于前期筛选的74-SNPs组合,采用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应（PCR）的原理构建SNPs的扩增体系,在微流控芯片的每个反应孔内完成一个SNP的检测,通过高通量PCR微流控芯片实现了其中72个SNPs的同步检测。芯片的扩增由平板PCR仪完成,反应孔的荧光信号通过激光共聚焦扫描仪检测,最终通过提取的荧光值进行结果分析。使用该芯片检测获得52份样本的SNPs分型,分型结果的准确率为100%。以57个人群的3628个样本为参考人群数据库,进行20份样本的族群来源推断,推断结果与样本的实际来源一致。本研究建立的常染色体72个SNPs微流控芯片体系可以有效地进行SNP多态性分析检测,基于参考数据库,20份检测样本族群推断的准确性为100%。     

用于磁珠法核酸提取的微流控芯片及自动化平台

基于磁珠法核酸提取原理,设计并制作出旋转驱动式核酸提取微流控芯片及自动化平台。微流控芯片包括裂解腔、清洗腔以及洗脱腔等结构,步进电机带动微流控芯片旋转,通过电磁铁吸附微流控芯片内的磁珠,实现磁珠在各腔室转移,完成核酸提取和纯化。对芯片表面疏水性、磁力大小、磁珠分散程度以及核酸洗脱时间进行优化。结果表明,当磁力大小为250 N时,可实现磁珠转移;磁铁放置于芯片上方1 mm时,腔室内磁珠分散程度最好。洗脱时间为20 min时,芯片上提取大肠杆菌的核酸浓度较高。微流控芯片与磁珠核酸提取技术相结合提取的核酸样本,可直接应用于后续聚合酶链式反应扩增环节,有利于实现核酸自动提取及扩增的一体化。     

液滴微流控系统在数字聚合酶链式反应中的应用研究进展

数字聚合酶链式反应( PCR)技术近年来发展迅速。与以实时荧光定量PCR为代表的传统PCR技术相比,数字PCR技术显著提高了定量分析的精确度和灵敏度。数字PCR的快速发展与近年来微流控技术在数字PCR技术中的广泛应用有着密切的联系。早期的研究和商业化产品使用的是大规模集成流路微流控芯片,加工过程复杂且价格高昂。近年来,液滴微流控芯片被应用到数字PCR技术中,它可以在短时间内产生102~107个微液滴,每一个微液滴都是最多只含有一个目的基因片段的PCR反应器。 PCR扩增后,通过对单个微液滴的观察计数,就可以获得绝对定量的分析数据。本文综述了不同种类的液滴微流控系统在数字PCR技术中的应用,以及液滴数字PCR微流控芯片在生物、医药、环境等领域的应用。     

基于3D打印技术的集成核酸提取芯片制备

基于固相萃取原理,设计并制作了一种集成核酸提取功能的微流控芯片,用于人体全血中脱氧核糖核酸(DNA)的提纯。芯片主要包括:混合微通道、裂解腔、DNA提取腔、DNA存储腔。采用3D打印技术制作出芯片模板,通过模板注塑成型、氧等离子体键合等工艺制作出微流控芯片。利用该芯片,可以在20 min内完成血液和试剂的顺序加载、快速混合、血细胞裂解、DNA的提取等操作,且试剂消耗量少。通过对所提DNA链上稳定表达的内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行PCR扩增,并对扩增产物进行熔解曲线分析,以验证所提取DNA的质量。     

负压驱动皮升级等温核酸精确定量微流控芯片

精准医疗急需更加精确、灵敏、方便快捷的核酸定量方法。设计开发了一种结合双荧光等温扩增的高密度皮升级核酸定量微流控芯片。芯片采用多层软光刻技术制成,有3个反应通道,每通道有40 000个反应小室,共120 576个皮升级反应小室,反应小室的密度达7 000/cm~2。芯片利用负压驱动样品精确分配,热凝固油相封闭小室,无需阀门及其他仪器辅助。芯片中嵌入的氟硅烷纳米涂层能有效地阻止反应过程中水蒸气的散失。以乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)质粒作为模板,进行等温多底物自配引发扩增(isothermal multiple self-matchinginitiated amplification,IMSA),测试芯片定量性能。芯片检测模板的动态范围达6个数量级,可检测的最大模板量为36μL中1.13×10~6拷贝数核酸。该装置具有定量精确、灵敏、快捷、操作简单等优势,可用于精准检测。     

激光诱导荧光微流控芯片分析仪的研制

研制了一种基于激光诱导荧光检测方法的微流控芯片分析仪。该分析仪使用玻璃基质聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片,可一次性进行12通道的电泳分离实验。仪器采用共聚焦式光路结构,并可通过检测由微流控芯片反射的激光信息,控制步进电机实现芯片的自动精确定位。实验结束自动保存数据,绘制分离图谱。。对9种不同长度的50 bp DNA Ladder片段进行电泳分离及数据分析,耗时在5 min内,且分离效果良好。     

微流控芯片-激光诱导荧光快速检测4种食源性致病菌

建立了食品中4种常见食源性致病菌的微流控芯片快速检测方法。根据副溶血弧菌的Vpara(16S-23S rDNA IGS)基因、沙门菌的invA基因、大肠杆菌O157:H7的rfbO157基因和志贺菌的ipaH基因序列设计了4对特异性引物,对上述致病菌进行四重PCR扩增,采用微流控芯片-激光诱导荧光检测食品中4种常见致病菌的多重PCR扩增产物。优化了多重PCR扩增和微流控芯片电泳分离的实验条件。当芯片电泳的筛分介质HPMC-50浓度为2.2%、溴乙锭(EB)含量为3.75μmol/L、电场强度为120 V/cm时,pUC Mix DNAMarker-8和待测致病菌的多重PCR扩增产物可以实现基线分离,600 s内即可完成上述4种致病菌的同时检测,迁移时间的日内相对标准偏差为0.74%~2.09%。本方法能够检出1×102cfu/mL的副溶血弧菌、沙门菌、大肠杆菌O157:H7和志贺菌。方法特异性高,所设计的引物在10种非目的菌株体系中均未见扩增的片段。将本法应用于食品中上述致病菌的测定,获得了满意的结果,为常见食源性致病菌的快速检测提供了一种新的可靠分析手段,对保障食品安全具有重要的现实意义。     

智能数字聚合酶链式反应系统的开发与应用验证

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)技术可以针对低浓度的目标核酸分子实现精确的绝对定量检测,在各类疾病的检测与治疗方面有着极大应用价值. 针对目前商业数字PCR仪造价昂贵、体积庞大等缺点,基于智能手机与微流控芯片,设计开发了一种低成本、高集成的智能数字PCR设备. 介绍了硬件系统的制作以及整机的整合搭建过程. 采用PID算法,结合温控电路与半导体制冷片等硬件,进行了PCR温度循环的精准控制. 最后,采用自适应阈值分割法对采集到的荧光图像进行了处理,并依据泊松分布的规律对统计结果进行了校正,完成了对PCR反应后采集到荧光图像的结果分析与检测.     

基于时间分辨免疫分析的冰毒检测微流控芯片

研制了一种聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)-多聚赖氨酸(Poly-l-lysine,PLL)玻片杂合微流控芯片,每张芯片有24条反应通道,每条反应通道体积仅为2.5μL,实现了基于时间分辨免疫分析技术的高通量冰毒(Methamphetamine,MET)定量检测。此芯片利用PDMS和PLL对蛋白质的吸附特性在反应通道内表面固定冰毒完全抗原(MET-BSA),使其与待测样品中的冰毒抗原(MET-Ag)共同竞争标记有冰毒抗体(MET-Ab)的乳胶微球。乳胶微球表面标记了镧系元素,在紫外光的照射下会发出红色荧光,根据竞争法检测原理,冰毒浓度越高,与反应通道内表面冰毒完全抗原结合的乳胶微球数量越少,所发出荧光强度越低。本芯片的结果读取采用紫外照射荧光成像方法,仅需对芯片拍摄荧光图像,即可实现24个样本的同时检测分析。本方法样品消耗量少,通量大,可以在100~3000 ng/m L浓度范围内实现对冰毒的定量检测,可用于缉毒的初步筛查,具有较好的应用前景。     

微流控芯片荧光检测系统研究进展

评述了1996～2010年以来微流控芯片荧光检测系统的研究进展,主要介绍微流控芯片中荧光检测系统,包括激光诱导荧光（LIF）、发光二极管（LED）诱导荧光和其他荧光检测装置的原理、光路结构及其应用（引用文献60篇）。