Aerolysin蛋白纳米孔道直接检测单个DNA碱基修饰

基于Aerolysin生物膜通道蛋白的纳米孔道电化学分析技术,因其高的电化学空间限域能力可实现超灵敏DNA单分子检测。本文利用单个Aerolysin纳米孔道在无需标记、无需扩增的条件下直接分辨3种具有单个碱基差异的单链DNA。实验结果显示,具有单个炔基侧链基团修饰的单个ss DNA在限域空间内与Aerol-ysin纳米孔道的相互作用时间较未修饰的ss DNA增长近7倍,电流阻断程度增大7%,且高斯峰半峰宽减小了44%,增强了Aerolysin纳米孔道对单个DNA分子的分辨能力。研究成果有望推动Aerolysin纳米孔在DNA直接测序及表观遗传修饰检测中的应用。     

离子液体电解质对DNA穿过α-溶血素纳米孔的影响

不同碱基的DNA分子空间占位和带电状态存在差异,其通过单个纳米孔时可引起特征性的电流脉冲变化,有望成为新一代单分子测序方法。然而,常规条件下DNA分子穿过纳米孔的速度很快(10~(-2)s),引起的电流变化小(pA级),因此分子亚结构信息的准确获取对现有仪器设备的性能提出了极高要求。本研究在α-溶血素纳米孔的两端分别引入高粘度和离子导电性较好的离子液体支持电解质,以构建粘度梯度体系,并对溶液的酸度进行优化,以期对ss DNA穿孔行为进行调控。初步的研究结果表明,在trans端为纯离子液体Bmim PF_6,cis端为1 mol/L Bmim Cl、10 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 5.5)的条件下,poly(dC)_(15)、poly(dC)_(20)、poly(dC)_(30)和poly(dC)_(50)均出现高抑制比的长阻断电流脉冲信号,长阻断事件的阻断深度达95%以上,持续时间达10~(-2)~10~(-1)s;同时,基线噪音峰峰值也降低约30%。对可能的机理进行了探讨。本研究结果表明,采用离子液体粘度梯度支持电解质体系可以有效调控ss DNA的迁移行为。     

基于高分子聚合物及毛细玻璃管的固态单纳米孔通道在分析化学中的应用

纳米孔检测技术以其独特的优势在电分析化学领域引起广泛的关注,基于此构建的电化学传感器及电化学整流开关已被用于多种目标物分析,如单分子蛋白检测及DNA测序。纳米孔既可由生物分子制成,也可由固态材料制备。其中,固态纳米孔易于修饰,机械性能、稳定性等相对较好,应用较为广泛。纳米孔检测技术主要的输出信号为电阻脉冲和电流-电压曲线(离子整流),本文以两种输出信号为重点,详细介绍了纳米孔检测的原理和应用,总结了近年来固态单纳米孔通道在分析化学领域的发展,并对该领域未来的发展趋势和应用前景进行了展望。     

生物纳米孔道技术在非基因测序方面的研究与应用

纳米孔道分析技术是一种低成本、快速、无需标记的单分子检测技术,仅有20多年的发展历史,在DNA单分子测序领域展示出较好的应用前景,现已有商业化的产品面世且趋于成熟.越来越多的研究表明,纳米孔可作为一个通用的单分子传感器.本文综述了生物纳米孔道分析技术对蛋白质、多肽和核酸等单个分子与孔道间相互作用、动力学和热力学过程的实时监测以及多种生物大分子和金属离子的定量检测等方面的研究进展.在纳米孔技术中,电化学检测系统也十分重要,本文还特别介绍了高带宽及超低电流分辨仪器和相关软件的相关进展.     

Aerolysin纳米孔核酸检测灵敏区域的协同相互作用探索研究

纳米孔单分子检测技术以其简便、快速、高通量及无需标记等特点, 应用于DNA及蛋白质测序, 更有望实现单分子动态构象变化的研究. Aerolysin(气单胞菌溶素)纳米孔道由于其特有的较长的β-桶限域区(β-barrel)及孔内壁丰富的带电荷氨基酸残基, 在单个寡聚核苷酸分子分析中展现出极高的灵敏性. 本设计利用dA₁₄-4-X, dA₁₄-11-X, dA₁₄-4-X-11-X (X=C, T, G)等单个寡聚核苷酸探针分子, 研究了Aerolysin的两个灵敏区域R1和R2, 探索了R1灵敏区域对单个碱基弱相互作用的差异, 实现区分单个碱基差异. 进一步实验证明, R1灵敏区域对单个碱基类型差异的灵敏区分不受R2灵敏区域被碱基A、C、T占位所影响. 然而, 当R2区域被碱基G占位时, 会使R1区域丧失对整个孔道电流的主导性. 本研究有助于理解Aerolysin对单个寡聚核苷酸分子的超灵敏测量机制.     

Aerolysin纳米孔道对寡聚核苷酸的高灵敏单分子检测

自纳米孔道单分子电化学技术提出以来,为了构建性能良好的纳米孔道,研究人员一直在寻找不同的孔道材料. 本研究探索了Aerolysin生物纳米孔道在寡聚核苷酸检测方面的可能性. 实验结果表明,与常用的α-溶血素纳米孔道相比,Aerolysin纳米孔道在寡聚核苷酸检测方面表现出更强的空间和时间分辨能力. 三个碱基长度的寡聚核苷酸可对Aerolysin纳米孔道造成约为40%的电流阻断. 阻断时间表现出电压相关性,随电压的升高而减小. 与其他生物纳米孔道相比,Aerolysin纳米孔道无需任何基因突变、化学修饰即可实现对单个寡聚核苷酸的超灵敏分析. 未来,Aerolysin纳米孔道将有可能应用于DNA损伤检测、microRNA分析以及其他基于纳米孔道的单分子分析检测.     

电化学限域SiN_X纳米孔道检测核酸分子的研究

固体纳米孔道因其机械强度高、尺寸可控、易于表面修饰及集成化设计等优点被广泛应用于DNA、RNA和蛋白质等生物分子的检测研究.为了检测单个单链核酸分子,本研究采用电化学刻蚀法可控制备了单个SiN_X固体纳米孔道,通过SiN_X固体纳米孔道限域空间效应增强了纳米孔道与短链核酸分子之间的弱相互作用,从而实现了核酸分子的单分子水平检测.通过研究不同孔径(3.1和8.5 nm)纳米孔道与核酸分子间的弱相互作用差异,有效区分了核酸分子在限域空间内产生的过孔和碰撞两种个体行为,加深了对固体纳米孔道限域空间内核酸分子电化学行为的理解.     

固态纳米孔对蛋白质易位的实验研究

蛋白质因其多样性和功能性,是生物体内一类非常重要的分子.通常蛋白质的表征需要借助荧光或者酶的标记.而纳米孔技术,得益于免标记、单分子检测等优势,为蛋白质的表征提供了新方向.我们使用固态纳米孔完成了单个蛋白质分子及蛋白质-蛋白质结合物的检测.可以发现,外部电压和电解质溶液的酸碱度会直接影响蛋白质分子表面带电量,从而加快或延迟其在孔内的易位时间.抗原、抗体本质上都是蛋白质,两者之间具有高度特异性.通过比较抗体溶液在添加特异性抗原前后的易位事件,实现了单个蛋白质分子和蛋白质-蛋白质结合物的区分.未来,纳米孔技术有望应用于多蛋白质分子的辨识、蛋白质分子相互作用机制等方面的研究.     

纳米孔道单分子电化学测量的低噪音控温系统研究

纳米孔道检测技术是一种利用单个分子测量界面实现在单分子水平上测量DNA、RNA、蛋白、多肽等生物分子的高灵敏的单分子检测技术. 由于单个分子与纳米孔道的相互作用受热力学控制,亟需精准控制纳米孔道单分子分析的实验温度. 因此,本文研制了一种低噪音控温系统用于具有皮安级电流分辨的纳米孔道单分子实验,以实现精确调控测量时的环境温度. 该系统利用半导体制冷片的热电效应对检测池环境加热/制冷,通过对高精度热敏电阻进行电磁屏蔽以实现在温度反馈的同时避免噪音的引入. 利用比例-积分-微分算法进行控制,达到高精度快速控温的要求. 该系统控温精度为±1 °C,无额外噪音引入至超灵敏纳米孔道单分子测量,获得了25 °C到5 °C下Poly(dA)5与单个气单胞菌溶素（Aerolysin）分子界面间作用产生信号的差异,应用于研究单分子与纳米孔道相互作用的热力学行为.     

基于石墨烯纳米材料的DNA测序研究进展

设计和研发快速、准确、价廉、高通量的DNA测序方法,对于预防早期疾病和了解相关疾病机理具有非常重要的意义。新型纳米材料石墨烯由于具有独特的结构和性质,在化学和生物科学等领域发挥着重要的作用。该文介绍了DNA测序的研究现状以及应用石墨烯纳米材料的优势,重点阐述了DNA链通过石墨烯纳米孔、石墨烯纳米间隙、石墨烯纳米带时产生不同的电流信号识别碱基序列的原理,同时介绍了DNA链与石墨烯的相互作用对DNA测序的影响,并对DNA测序的研究方向进行了展望。该文为基于石墨烯纳米材料的DNA测序提供了作用原理、理论研究以及检测方法等参考。     

纳米通道单分子检测P53蛋白与DNA的弱相互作用

利用基于α-溶血素(α-HL)的纳米通道单分子检测技术在单分子水平上探测位于肿瘤抑制蛋白P53 DNA结合域的多肽分子(P53-P)与含有p21^waf1/cip1基因结合域的双链DNA (B40)之间弱相互作用. 在电场力的作用下, 单个P53-P/B40复合物被α-HL纳米通道捕获并限制在其前庭中. 通过空间限域作用, P53-P与B40之间的弱相互作用被放大为具有显著电压依赖性的复合物-α-HL间强烈的相互作用, 从而产生极易分辨的离子流特征阻断信号. 统计分析特征阻断信号显示P53-P与B40之间的弱相互作用使得B40产生微小的构型变化. 分子对接模拟进一步证明, P53-P能够插入B40的小沟并使得小沟间距变窄. 因此, 基于α-HL的纳米通道单分子检测技术可以作为研究单个生物大分子间弱相互作用的超灵敏分析方法.     

基于Aerolysin纳米孔道对单个c-di-AMP分子的检测研究

环二腺苷酸(c-di-AMP)是原核细胞中普遍存在的第二信使, 不仅能够有效调控细胞生长、离子转运、细胞壁代谢平衡等多种生理过程, 还能引发I型干扰素应答, 激发机体天然免疫反应. 本实验使用单个气单胞菌溶素(Aerolysin)纳米孔道蛋白构建的单分子界面, 对c-di-AMP进行单分子测量研究. 为提高Aerolysin纳米孔对带负电小分子化合物的测量灵敏度, 本实验利用LiCl为支持电解质, 有效屏蔽Aerolysin孔口表面负电荷, 减小c-di-AMP与Aerolysin纳米孔之间的静电排斥, 从而显著增强了Aerolysin纳米孔道对单个c-di-AMP分子的检测能力. 实验结果显示, 在90 mV电压下, 每分钟在LiCl中获得的有效穿孔事件的数量最高可达同条件KCl支持电解质的30倍, 且有效穿孔事件占总体事件的比例在不同电压下提升了7~11倍. 进一步表明, 使用LiCl支持电解质, 可有效增强Aerolysin孔道对带负电小分子化合物的测量灵敏度. 因此, 本研究实现了Aerolysin纳米孔道对单个环二核苷酸的高灵敏免标记检测, 有望为单分子水平上阐明新型免疫干扰机制提供新的分析方法.     

固相纳米孔对核酸组装的“免标记、均相”表征和应用探索

随着核酸自组装领域的飞速发展,除了作为遗传信息的载体外,核酸成为了一种具有高操作自由度和无限可能性的功能材料.基于核酸自组装原理的DNA纳米技术凭借其强大的可编辑性已经广泛应用于生物传感、纳米材料工程、医学诊疗以及分子计算机等领域.纳米孔作为一种新兴的单分子分析技术具有高分辨、高通量、免标记等特点,近年来在基因测序、分子物理化学性质分析等领域展示出了极大的应用潜力.作为一种新型高分辨表征技术,纳米孔已经在DNA纳米技术研究中崭露头角,被用于原位追踪和分析核酸分子的自组装行为.另一方面,DNA纳米技术也为纳米孔传感所面临的技术瓶颈提供了更多样化的解决思路,如借助功能核酸(Aptamer或DNAzyme)和无酶扩增核酸分子线路实现纳米孔对待测物的特异性增敏检测.本专论旨在通过对近期纳米孔技术与核酸自组装的跨领域研究成果进行系统性回顾,总结并展望纳米孔传感领域内核酸自组装的研究进展,以期为单分子生物分析、信息检索、基因分型和临床诊断等领域提供新思路和新方法.     

液体环境单分子免疫球蛋白G的原子力显微镜高分辨成像

原子力显微镜技术( AFM)具有纳米级高分辨成像能力,是研究生物大分子结构和功能的重要工具之一。制备合适的样品是获取高分辨成像的关键要素。本研究结合DNA折纸技术,将抗原分子修饰在DNA折纸上,通过分子识别作用,抗体分子与抗原分子特异性结合,形成由DNA折纸和抗原抗体复合物构成的纳米结构。利用DNA折纸在云母表面上的吸附特点,使得抗体分子选择性地吸附在衬底表面上,由此获得了液体环境中的单个地高辛抗体免疫球蛋白G( IgG)分子的“Y”超微结构形貌。本方法简单、方便,为AFM在单分子水平上检测和表征生物分子结构和功能提供帮助。     

玻璃纳米孔洞电极的制备及对环糊精单分子的检测

采用玻璃毛细管融封后打磨,直接得到了纳米孔洞玻璃电极。此电极洞壁厚实坚固,容易操作,电流噪声低,可实现对β-环糊精单个分子的检测。发现单个环糊精分子可以产生清晰分辨的两种幅度的电流脉冲,提出是环糊精在孔洞内的两种取向造成的。脉冲幅度与孔洞尺寸密切相关。在(10±5)nm的孔洞电极上可以得到2～5pA的响应脉冲。研究了电压大小与方向的影响,结果表明,电渗流对检测影响显著。在电渗流方向与环糊精扩散方向相反的条件下,100～600mV电极电位即可产生良好的脉冲信号,但平均脉冲宽度随电极电位的增大呈线先增大后减小的趋势,约在300mV电位下脉冲宽度最大。     

纳米孔道单分子电化学信号在线识别与分析研究

为实现纳米孔道单分子检测中对微弱电流信号的快速精准处理,考察了纳米孔道实验数据的信号特征,提出了基于双缓冲数据结构和有限冲击响应滤波的实时自适应阈值法,并基于这一算法设计了纳米孔道信号在线识别与分析系统,实现了实验数据实时采集存储和信号在线分析处理的同步进行。为验证所建立的纳米孔道信号在线识别和分析系统性能,采用噪音为20~100 p A和带宽区间为3~100 k Hz的仿真信号进行信号识别分析。结果表明,本系统能够满足强噪声、低带宽、高采样率(250 k Hz)环境下对实验数据处理的要求。将此系统应用于单个poly(dA)_4分子的Aerolysin纳米孔道分析实验中,实验结果表明,本系统能够对大数据量的纳米孔道实验数据进行实时、快速、精准的分析处理。     

用于纳米孔道分析的四通道电化学传感器设计与仿真

纳米孔道技术是一种基于空间限域的超灵敏的单分子分析技术.通过研究单个分子限域于纳米孔道中所产生的离子电流的变化,可在单分子尺度上获取其结构、尺寸、电性及与孔道间弱相互作用的信息.目前主要应用的纳米孔道测量仪器单次实验仅能测量单个纳米孔道,其检测通量较低.本文基于实验室前期自主设计研制的单通道纳米孔道测量仪器Cube-D2上,比较研究了两种互阻放大器的测量特性,从而选择了合适的测量电路设计了四通道电化学传感器放大电路.进一步通过仿真验证了四通道电化学传感器设计方案的可行性,为阵列化高通量纳米孔道单分子电化学测量仪器的设计提供了理论基础.     

石墨烯纳米孔的制备及λ-DNA穿孔初步研究

纳米孔测序是有可能实现"$1,000 Genome"目标的技术之一.近年来,研究较多的纳米孔有蛋白质纳米孔和硅基材料的固态纳米孔.蛋白孔寿命比较短,而基于硅基底的固态纳米孔深度显著超过单链DNA相邻碱基的间距,所以,无法实现DNA的单个碱基的分辨.作者用聚焦离子束先制造氮化硅基底,并在该基底上铺设石墨烯,再用聚焦电子束刻蚀石墨烯,获得直径10 nm以下的纳米孔,初步分析了DNA穿越纳米孔时产生的电信号及穿孔噪音,向单层石墨烯纳米孔测序DNA迈出了一步.     

基于单链核酸-纳米金-汞模拟酶的汞离子检测方法研究

将汞离子(Hg2+)沉积到吸附单链核酸(ssDNA)的纳米金(AuNPs)表面后,可以提高纳米金的模拟过氧化物酶活性,基于此原理可实现Hg2+的高灵敏检测。研究发现ss DNA能够促进Au NPs-Hg2+的类似过氧化物酶活性,且随着ss DNA浓度的增加,该作用呈增强趋势。在优化反应条件下,将ss DNA-Au NPs-Hg2+模拟过氧化物酶用于Hg2+的检测,Hg2+的检测线性范围为10~1 000 nmol/L,检出限可达3.0 nmol/L。该检测方法具有简便快速、成本低、稳定性高等优点,有望用于环境、食品等样品中Hg2+的检测。     

单个体矢量性特征的固体纳米孔道分析研究

固体纳米孔道作为一种高灵敏的单分子检测技术,由于其机械强度高、尺寸可控、易于阵列化集成等方面的显著优势,已经被广泛应用于DNA,蛋白质以及聚合物等小分子的检测.具有矢量性特征的各向异性单个体在纳米孔道中的穿孔行为对具有空间限域效应的纳米孔道离子流特征信号具有显著影响.为解析单个体矢量性特征对纳米孔道分析的影响,本工作利用氮化硅固态纳米孔道,以单个纳米金棒为各向异性的单个体模型,实时观测了其在孔道中的迁移行为.研究发现当纳米金棒穿过纳米孔道时,产生两种不同阻断程度的特征电流信号,通过对电流信号事件的解析,实时获取了具有矢量特征的金棒所导致的两种特征过孔事件;进一步,建立了离子电流模型,分别对这两种各向异性的穿孔事件机制进行了验证.