基于链置换循环无标记检测端粒酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂, SYBR Green Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针, 发夹核酸探针为分子识别探针, 基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应, 建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA(hTR)的荧光新方法. 发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面, 嵌插在发夹DNA探针茎部的SGⅠ的荧光信号被GO猝灭. 当人工合成的目标物(T1)存在时, T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应, 由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链. 刚性的双链DNA脱离GO表面, 导致所嵌插的SGⅠ产生较强的荧光信号. 基于荧光信号的变化, 可定量检测0.2~50 nmol/L的T1, 检出限为90 pmol/L. 该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、 高特异性且无需标记的荧光新途径.     

基于适配体-杂交链式反应比色检测生鲜牛乳中四环素类抗生素

以特异性识别四环素类抗生素(TCs)的广谱型适配体为识别元件,结合杂交链式反应(HCR)信号放大策略,提出了一种TCs多残留比色检测方法,并优化了检测条件和进行了方法学考察。取40 nmol·L^-1生物素化检测探针(bio-DP)溶液加入到包被有亲和素的酶标板中,室温孵育后加入牛血清白蛋白(BSA)溶液,封闭反应1 h。加入生鲜牛乳样品稀释液,室温孵育20 min,如果样品中含有TCs, TCs与bio-DP的适配体序列结合,其发夹结构被打开。加入200 nmol·L^-1生物素化发夹DNA1(bio-H1)溶液和200 nmol·L^-1生物素化发夹DNA2(bio-H2)溶液,室温下进行HCR 40 min,从而形成具有多个重复单元的双链DNA(dsDNA)纳米线。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(SA-HRP),室温孵育标记dsDNA。加入显色剂[含3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)],HRP催化TMB生成蓝色物质,显色5～8 min后终止反应,在酶标仪中于450 nm测量上述体系的吸光度。结果显示,...     

基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测

设计合成了一种长臂发夹型核酸探针,结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法.当不存在靶DNA时,SYBR GreenⅠ荧光染料能够嵌入发夹型探针的茎部而发出很强的荧光,而当存在靶DNA并与发夹型探针杂交后,核酸外切酶Ⅲ从杂交产物的3'端开始水解发夹型探针,释放出靶DNA,并触发下一个酶水解反应,同时SYBR GreenⅠ染料也随发夹型探针水解而释放,导致荧光信号降低,从而实现了对DNA的免标记荧光信号放大高灵敏检测.该方法的检出限低至320 fmol/L,比传统双标的分子信标的方法降低了4~5个数量级,且该方法还具有免标记、简单、快速的特点.     

基于链置换循环无标记检测端立酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂,SYBRGreen Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针,发夹核酸探针为分子识别探针,基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应,建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA (hTR)的荧光新方法.发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面,嵌插在发夹DNA探针茎部的SG Ⅰ的荧光信号被GO猝灭.当人工合成的目标物(T1)存在时,T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应,由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链.刚性的双链DNA脱离GO表面,导致所嵌插的SG Ⅰ产生较强的荧光信号.基于荧光信号的变化,可定量检测0.2～50 nmoL/L的T1,检出限为90 pmol/L.该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、高特异性且无需标记的荧光新途径.     

氧化石墨烯增强荧光各向异性新策略在microRNA检测中的应用

microRNA(miRNA)是一类与癌症等重大疾病的发生密切相关的非编码小分子RNA.本文基于氧化石墨烯(GO)放大荧光各向异性(FA)原理,构建了GO/cDNA/Linker DNA/pDNA(DNA-GO)复合探针体系,结合靶物催化诱导信号循环放大策略,实现了miRNA-21的灵敏检测.在复合探针形成后,GO增加了荧光旋转体的体积和质量,Linker DNA上染料分子的荧光各向异性值增大.miRNA-21可通过"toehold"介导的链置换反应与Linker DNA杂交,使pDNA脱离Linker DNA.进一步加入Fuel DNA后,Fuel DNA与Linker DNA配对形成双链,从GO表面脱离,使Linker DNA上染料分子的荧光各向异性减小.被置换下来的miRNA-21进入下一循环,因此一个目标分子可以诱导形成多个Fuel DNA与Linker DNA的杂交双链,使荧光各向异性进一步减小.利用减小的荧光各向异性值实现了miRNA-21的灵敏检测.在本方法中,荧光各向异性减小值与miRNA-21浓度在10~330 nmol/L范围内呈线性关系,检测限为1.09 nmol/L.     

基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷

本文提出了一种基于磁性辅助的杂交链反应放大检测三磷酸腺苷(ATP)的传感策略。磁性纳米粒子表面易于修饰,而且操作方便,具有很好的分离效果,能够提高生物传感的选择性。首先,利用生物素与链霉亲和素之间的亲和力作用,将生物素标记的ATP核酸适配体连接到链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子表面,加入与ATP核酸适配体互补的一段DNA进行杂交,通过磁性分离除去未杂交上的DNA,加入靶向ATP,ATP与其适配体特异性结合将适配体的互补链通过磁性分离出来,磁性分离出的信号DNA继续用于下一步的杂交链反应,将信号放大,最后利用氧化石墨烯(GO)对荧光的猝灭效应降低背景荧光,达到高灵敏度、高选择性检测靶向ATP。其中,ATP的最低检测浓度为0.1nmol/L。     

基于杂交链式反应和共价有机框架的新型荧光传感器用于ctDNA的高灵敏和选择性检测

共价有机框架是近年来发展起来的一种高度结晶的多孔聚合物,由有机单元连接形成。由于其优异的孔隙率,模块性,结晶性和生物相容性,在传感领域显示出良好的应用前景。本文开发了一种基于杂交链式反应 (HCR) 和共价有机框架的新型荧光传感平台,用于高灵敏的检测循环肿瘤DNA (ctDNA)。ctDNA可以作为HCR的激活剂,通过触发发夹1 (H1) 和发夹2 (H2) 的自主交叉打开,激活HCR形成延伸的有缺口的双链DNA,导致荧光信号的变化,从而实现ctDNA的定量检测。HCR产物和荧光信号分别采用琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱进行表征。ctDNA浓度在0-10 nM范围内,ctDNA的浓度与荧光信号呈良好的线性关系,检测限为1.3 nM。该方法对ctDNA具有满意的选择性,并在人类血清样品中显示出良好的性能。该荧光传感平台为ctDNA的检测提供了新思路,在癌症早期诊断中显示出潜在的应用前景。     

基于银镜表面的比色法DNA传感器

本文以银镜反应所做的银板作为固相载体材料,通过形成DNA三明治结构,利用辣根过氧化物酶(HRP)催化放大信号,建立特定序列DNA的比色检测方法。经过优化实验条件后,对不同浓度DNA进行检测。结果表明,DNA浓度在0.1~3.0nmol/L范围内呈现良好的线性响应,其检测限低至22.0pmol/L。所建立的DNA比色检测方法具有准确的识别能力,能够区分互补与错配序列。     

基于杂交链式反应的可视化免疫分析检测癌胚抗原

构建了基于杂交链反应的比色免疫分析方法,实现了对肿瘤标志物癌胚抗原的检测。在抗原-抗体的特异性结合作用下,在磁珠表面构建夹心式免疫复合物,进一步结合杂交链式反应(HCR)作为信号放大策略,将染料曙红Y嵌入至DNA长链中。在可见光的照射下,能使反应底液中的四甲基联苯胺(TMB)氧化,发生明显的颜色变化,由无色变为蓝色,且与癌胚抗原的浓度呈正相关性。在最优实验条件下,癌胚抗原的浓度在1 pg/mL^5 ng/mL范围内呈线性变化,检出限为1 pg/mL。     

基于纳米生物条形码和杂交链式反应构建电化学生物传感器用于蛋白激酶活性分析

该文结合纳米生物条形码和杂交链式反应(HCR)双重信号放大策略构建了一种电化学生物传感器用于蛋白激酶A(PKA)的活性分析。以MoS₂/AuNPs纳米复合材料作为玻碳电极修饰材料，半胱氨酸修饰的底物肽链通过Au-S键自组装到修饰电极表面。当存在目标物PKA时，底物肽链被磷酸化，可与纳米生物条形码(S1-AuNPs-Ab)特异性结合，以S1-AuNPs-Ab探针中S1链作为引发链，可诱导发夹DNA(H1和H2)发生杂交链式反应。HCR产物吸附亚甲基蓝(MB)电活性分子，产生放大的电化学响应信号，实现对PKA活性的定量分析。该电化学传感器检测PKA的线性范围为10^-3～20 U/mL，检出限(S/N=3)为3×10^-4 U/mL。构建的电化学传感器具有良好的选择性、重现性和稳定性，可用于实际样品细胞裂解液中PKA的活性测定和蛋白激酶抑制剂的筛选及激酶相关药物的发现。     

基于DNA双链取代策略免标记检测铅离子的研究

建立了一种基于DNA双链取代策略和SYBR GreenⅠ(SG)作为荧光染料插入剂进行免标记铅离子检测的荧光传感方法。SG作为一种染料分子,与单链DNA作用产生的荧光强度很弱,但可以插入双链DNA,使SG荧光强度明显增强。检测时铅离子适配体首先与其部分互补单链DNA杂交形成稳定的双链DNA结构,当溶液中存在铅离子时,铅离子与其适配体特异性结合,双链DNA的数量减少,加入SG可实现铅离子的免标记定量检测。此方法具有灵敏度高、特异性强、简便快速等优点。最低检测浓度为2 nmol/L,检出限(S/N=3)为1.6 nmol/L,实际样品检测结果良好。     

基于切刻内切酶信号放大的电致化学发光DNA生物传感器的研究

利用切刻内切酶的酶切作用实现信号放大,结合量子点高效的电化学发光性能,构建了一种新型电化学发光DNA生物传感器.将捕获探针DNA(c-DNA)通过自组装的方式固定到金电极表面,后与目标DNA(t-DNA)互补杂交形成双链DNA,利用切刻内切酶Nt.BstNBI特异性识别双链上的酶切位点(5'-GAGTC-3'),然后在c-DNA相应的切割位点(识别序列3'端后的4个碱基处)对其进行剪切,释放出目标链,参与下一轮的杂交及酶切,通过目标物的循环利用,实现信号放大.利用N-羟基琥珀酰亚胺(N HS)和1-乙基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)活化羧基化CdTe量子点表面的羧基,与电极表面残留的c-DNA末端的氨基共价交联,通过测定捕获的量子点的电化学发光信号对目标DNA进行检测.优化后的检测条件为:c-DNA浓度1 μmol/L,杂交时间60 min,Nt.BstNBI浓度0.5 U/μL,酶切反应时间4h.在优化条件下,目标DNA浓度在2.0×10-13～2.0×10-11 mol/L范围内,其对数与电化学发光强度呈线性关系,检出限为7.3×10-14 mol/L.人体血样加标回收率为96.4％～108.0％.     

杂交链式反应介导赭曲霉毒素A的比色/荧光双模检测

以赭曲霉毒素A(OTA)为目标物,以二氧化硅纳米颗粒作为载体,负载赭曲霉毒素适配体和HCR引发链(cDNA)杂交的DNA双链,构建了一种比色/荧光双模信号输出的高灵敏检测平台。在最优条件下,荧光信号回归方程为ΔF=1033.78lgc+13652.89,检出限为6.11×10^-14 g/mL;比色信号回归方程为A=0.02587lgc+0.7537,检出限为1.33×10^-13 g/mL。该方法成功应用于实际样品中OTA的检测,为食品安全监测提供了一种新策略。     

DNA/银纳米簇荧光探针在检测Pb2+中的应用

基于DNA/银纳米簇的荧光特性报道了一种简单、灵敏、高选择性的荧光方法检测Pb²⁺.以茎部为富G结构,环状部分为聚C结构的发夹型DNA为模板合成具有稳定荧光的银纳米簇.当加入Pb²⁺后,发夹型DNA在Pb²⁺诱导下形成G-四链体结构,破坏了发夹型DNA的构型,极大地影响了合成银纳米簇的模板结构,导致银纳米簇的荧光强度降低.Pb²⁺存在和不存在时所产生荧光强度的差异与发夹型DNA的碱基序列和茎部配对碱基数有关.依据这一现象,在优化DNA碱基序列和茎部配对碱基数的基础上,可实现100 μmol/L至100 nmol/L范围内对Pb²⁺的定量检测,检出限为10 nmol/L.该方法对Pb²⁺的检测具有较好的选择性,并可应用于实际水样中Pb²⁺的检测.检测结果与原子吸收光谱进行比对,显示出较好的一致性.     

基于碳量子点-银纳米簇荧光共振能量转移纳米探针的荧光传感器检测转基因成分CaMV35S

利用荧光共振能量转移(FRET)纳米探针结合催化发夹组装(CHA)无酶扩增信号放大途径建立了一种可用于转基因成分的荧光检测方法。首先为CaMV35S目标序列(tDNA)设计了可诱导的CHA循环的两个发夹结构序列HP1和HP2。当单链DNA标记碳点(sDNA-CDs)和DNA模板化银纳米团簇(Ts-AgNCs)杂交后,AgNCs和碳量子点(CDs)靠近,形成FRET效应,得到sDNA-CDs/Ts-AgNCs荧光猝灭的比率荧光探针。当tDNA存在时,通过杂交反应打开HP1发夹,形成HP1-tDNA双链结构;该结构可将HP2的发夹结构打开,从而形成HP1-HP2双链结构,同时释放出tDNA进入下一轮杂交,触发CHA循环。由于HP1-HP2中HP1的部分序列与Ts部分序列间的亲和性较sDNA强,因此,加入sDNA-CDs/Ts-AgNCs后,sDNA-CDs从探针中释放,使CDs(λ_em=464 nm)的荧光得以增强。而AgNCs仍在双链结构中,其荧光强度(λ_em=560 nm)基本保持不变。以I_F464/I_F560...     

无标记电化学生物传感平台用于癌胚抗原的检测

基于目标物诱导DNA杂交链式反应(HCR)及银纳米颗粒(Ag NPs)自组装过程构建了无标记型电化学生物传感平台,并将其应用于癌胚抗原(CEA)的检测.在目标物存在的情况下,适配体对CEA进行特异性识别并结合,释放出与之互补的触发DNA链(t DNA).该t DNA能够被金电极上的捕获探针(c DNA)捕获,并启动HCR过程,使得两条发夹DNA链被相继打开并串联成长的DNA双链结构,带正电的Ag NPs通过与该DNA结构之间的静电作用大量自组装到电极表面,并产生强的电化学信号.在优化的实验条件下,该电化学生物传感平台能够在0.5 ng·L~(-1)到50μg·L~(-1)的浓度范围内实现对CEA的良好响应.     

基于催化发夹组装和荧光共振能量转移的生物传感器检测EV71病毒

以肠道病毒71型(EV71)为检测对象，建立了基于催化发夹组装(CHA)和荧光共振能量转移(FRET)的生物传感器。设计了检测EV71 VP1基因的CHA信号放大策略，该体系由一对发夹探针(H1、 H2)构成，H1和H2分别标记了荧光基团Cy3和Cy5。当体系中有VP1基因时，可引发H1和H2催化自组装反应，从而使得Cy3和Cy5相互靠近并发生FRET,导致Cy3荧光信号降低，Cy5信号增强；当体系中没有VP1基因时，H1和H2则稳定存在于反应体系中，不发生FRET,只检测到Cy3的荧光信号。优化了缓冲液浓度、 H1与H2的比例、反应温度和反应时间。在最优条件下，所构建的传感器的Cy5与Cy3的荧光强度比值与EV71 VP1基因浓度在0.5～20 nmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为73 pmol/L(3σ)。咽拭子样品的加标回收率为99.6%～103.1%,相对标准偏差在0.3%～1.7%之间。本方法具有较好的特异性及抗干扰能力，在EV71监测和手足口病早期诊断方面具有良好的应用前景。     

基于酶辅助靶标循环的适体传感器灵敏检测中药中黄曲霉毒素B1

该文基于酶辅助靶标循环信号放大策略构建了用于黄曲霉毒素B1(AFB1)高灵敏检测的化学发光适体传感器。以G-四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子设计了免标记的适体探针H1-S1和发夹探针H2。适体探针结合目标AFB1,在核酸外切酶I辅助下,触发靶标循环反应产生发夹H1。发夹H1与H2杂交,释放出完整的G-四链体序列,并进一步与氯化血红素结合形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。DNA酶通过催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系产生化学发光信号,实现AFB1的放大检测。在最优实验条件下,化学发光强度与AFB1质量浓度的对数在0.001~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(r2)为0.9955,检出限为0.93 pg/mL,回收率为93.7%~107%。该适体传感器操作简单、灵敏度高、特异性好,在黄曲霉毒素污染检测方面具有良好的应用前景。     

功能化纳米金放大的DNA电化学传感器研究

研究了DNA夹心杂交和直接杂交体系,将功能化纳米金引入到标记有生物素的杂交双链上,制成具有电化学活性和纳米金放大作用的DNA电化学传感器,采用循环伏安法测试.在夹心杂交体系中,靶点DNA浓度与阳极峰电流关系曲线的相对标准偏差为3.0%～13.0%,在浓度为6.9×10^-3～0.14nmol/L范围内得到良好的线性关系,检测限达到2.0×10^-3nmol/L,实现了对单碱基突变的高灵敏检测和序列识别.直接杂交检测限为2.5×10^-4mol/L,分别在2.5×10^-4～5.0×10^-3nmol/L和5.0×10^-3～10nmol/L范围内得到峰电量与浓度的良好线性关系.并比较这两种体系.     

核酸适配体识别-荧光法检测赭曲霉素A

建立了核酸适配体识别-荧光探针技术检测赭曲霉素A(OTA)的新方法.基于微孔板上固定的核酸适配子与目标物质OTA结合时构象发生变化,导致预先与其互补杂交的FAM标记短链DNA解离,引起荧光信号发生变化,据此可实现对OTA的定量检测.当微孔板包被亲和素浓度为25 mg/L、适配子浓度为50 nmol/L,FAM标记互补短...