多维液相色谱-质谱用于酶解猪血蛋白中活性肽的研究

以强阳离子交换柱（SCX）为一维色谱柱,反相柱（RP）为二维色谱柱,采用在线捕集接口形式,通过10通阀连接一、二维色谱柱,构建了二维液相色谱分离系统。将该系统用于酶解猪血蛋白中对血管紧缩素Ⅰ转移酶（ACE）具有活性抑制作用的肽进行分离、鉴定,共检测出104个组分。收集一维馏分,离线注入LC—MS,鉴定出其中含有SAL、DKF、ESF、STVL及FESF5个小肽。     

六味地黄丸组分的二维液相色谱分离

以1个常规六通阀直接连接两支常规尺寸的色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.),构建简单的SCX/RP在线二维液相色谱系统,对中成药六味地黄丸组分进行了优化分离。样品经过第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX),洗脱产物分离后通过六通阀直接富集到反相分析柱(C18)顶端,被转移到第二维色谱柱上继续进行分离。经过11步不连续的线性梯度洗脱,二维分离系统出峰数量达到550多个,峰容量达到2266。构建的二维液相色谱系统结构简单,与一维色谱相比,具有分辨率高、峰容量大的特点。     

六昧地黄丸组分的二维液相色谱分离

以1个常规六通阀直接连接两支常规尺寸的色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.),构建简单的SCX/RP在线二维液相色谱系统,对中成药六味地黄丸组分进行了优化分离.样品经过第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX),洗脱产物分离后通过六通阀直接富集到反相分析柱(C18)顶端,被转移到第二维色谱柱上继续进行分离.经过11步不连续的线性梯度洗脱,二维分离系统出峰数量达到550多个,峰容量达到2266.构建的二维液相色谱系统结构简单,与一维色谱相比,具有分辨率高、峰容量大的特点.     

IEX/RP二维液相色谱中弱保留组分收集模式的构建及系统评价

以十通阀和捕集柱接口形式,构建了弱阴离子交换/反相(WAX/RP)二维液相色谱分离系统.通过将第一维离子交换色谱分析中的前部集中洗脱出的弱保留组分收集后单独分析,剩余样品进一步采用二维液相色谱分析,可以有效避免第二维色谱柱对特殊样品局部集中流出导致的第二维分离超柱容量问题,提高了系统的整体分离能力.使用4种蛋白胰蛋白酶酶解后的多肽样品评价该系统,在不分流的系统中共检测到115个峰.对第一维分离的前15 min分流后得到的组分单独分析,共识别出58个峰,后续的二维分离中共得到78个峰.2种方法相比,第二种方法检测峰数增加了21个,一些低丰度的组分在弱保留组分收集后被识别.     

二维液相色谱(SCX/RP)系统的构建及对珠蛋白水解产物的研究

以十通阀为切换接口, 构建了SCX/RP常规柱二维液相色谱系统, 并以珠蛋白水解产物的分析对其加以评价. 样品首先由第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX, 100 mm×4.6 mm I.D.)在pH 4.0的磷酸盐缓冲体系中分离, 洗脱产物进入切换接口, 样品组分被富集在捕集柱(Hypersil BDS C18, 15 mm×4.6 mm I.D.)中, 进一步脱盐后被导入第二维反相色谱(Hypersil BDS C18, 250 mm×4.6 mm I.D.)分离分析. 阳离子交换色谱采用逐步增加盐浓度的12步台阶等度间断方式洗脱, 每次将洗脱产物捕集在捕集柱中进而由反相色谱分析, 实现对第一维洗脱产物的切割转移及第二维分析. 与一维色谱相比, 二维液相色谱系统的分辨率、峰容量也得到提高, 系统峰容量达到2280.     

强阳离子交换毛细管液相色谱-反相加压毛细管电色谱二维系统的构建及其在中药黄柏提取物分离中的应用

加压毛细管电色谱(pCEC)具有电泳和液相色谱的双重分离机理,其柱效高、选择性强、分辨率高和分离速度快并可进行梯度洗脱。我们在此基础上加入离子交换色谱模式,构建了强阳离子交换-反相加压毛细管液相色谱(micro strong cation exchange liquid chromatography/reversed phase pressurized capillary electrochromatography, μ-SCXLC/RP-pCEC)二维系统,并对中药黄柏的提取物进行了优化分离。第一维μ-SCXLC采用线性盐梯度分离,样品被切割成11个馏分洗脱收集后进入第二维,第二维脱盐后,采用RP-pCEC进行分离分析,梯度洗脱。以中药黄柏提取物为样品,此二维系统的分辨率和峰容量都较一维系统有很大提高,理论峰容量可达900左右,证明构建的二维体系非常适合复杂样品的分离分析。     

填充毛细管液相色谱-毛细管气相色谱在线联用技术

建立了一套填充毛细管液相色谱－毛细管气相色谱在线联用的二维色谱分离体系。联用接口由十通阀和多位阀构成，将经填充毛细管液相色谱分离后的样品各馏分在线准确切割和储存，并在线无损失输送至ＧＣ分析，从而实现了复杂样品的一次进样全组分的分离分析。     

高温二维液相色谱系统的构建及其评价

在二维液相色谱中, 第二维的分离速度是制约其发展的重要因素. 升高色谱柱温度可以有效降低流动相粘度, 加快溶质在两相间的传质速率, 有效加快分析速度. 以离子交换色谱法(WAX)为第一维分离模式和反相色谱法(RP)为第二维分离模式, 十通阀和两个捕集柱为接口, 通过将第二维色谱柱温度升高到80 ℃和提高流量到3 mL/min, 构建了高温WAX/RP二维液相色谱系统. 以4种标准蛋白的酶解物为样品评价系统的分离性能, 第一维共有33个馏分被捕集并导入到第二维分析, 高温二维液相色谱系统识别出187个色谱峰.     

基于在线二维色谱的不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析

建立了基于在线二维弱阴离子交换色谱-反相液相色谱(2D-WAX-RPLC)的蛋白质分离系统,并用于不同生长时期鹿茸的比较蛋白质组分析。以5种标准蛋白质的混合物为样品,考察了系统的重现性。通过改变标准蛋白质之间的浓度比,研究了该系统进行蛋白质相对定量的能力。在此基础上,针对4个不同生长时期的鹿茸样品,分别采用5种不同的方法进行蛋白质提取,经2D-WAX-RPLC分离后,收集各生长时期对应蛋白质的峰高最大比超过2的组分。酶解后,采用微柱反相液相色谱-串联质谱(μRPLC-MS/MS)进行肽段的分离鉴定;共从9个差异蛋白质峰中鉴定到了22个差异蛋白质。研究结果表明,利用基于蛋白质水平的在线二维液相色谱分离技术找寻差异蛋白质,具有重现性好、自动化程度高等优点,可用于开展比较蛋白质组学的研究。     

用于人血浆中蛋白质分离的在线阵列式二维常规柱液相色谱系统的建立

构建了一种在线阵列式二维常规柱液相色谱系统,并将其应用于分离血浆中的完整蛋白质。该系统以1根强阴离子交换柱作为第一维分离柱,8根阵列式反相色谱柱作为第二维分离柱。强阴离子交换柱分离的馏分通过十通阀被依次转移到第二维预柱上并得到保留富集,随后第二维流动相通过分流器同时将预柱上的蛋白质反冲至分析柱上进行分离。二维之间以及第二维阵列色谱柱之间均相互独立,从而可以提高系统分离的通量和总峰容量。采用该系统对血浆中的蛋白质进行了完整蛋白质水平上的分离。该系统具有高通量和高分辨率的特点,为血浆样品中高丰度蛋白质的去除以及血浆样品的深入研究提供了一种有效的手段。     

色谱最新研究亮点（第7期）

1多维分离技术新进展 一维色谱是目前最常用的分离分析方法,然而对于复杂体系如蛋白质组,采用一维分离模式其分离度远远不能满足要求。Giddings理论告诉我们：对于分离机理相互正交的二维分离系统(如色谱),峰的容量应该为两个色谱柱峰容量的乘积。因此,多维分离系统是解决复杂分离体系的一个最佳选择。在多维色谱中二维气相色谱发展较快,目前全二维气相色谱仪业已商品化,其峰的容量达到104以上。而二维液相色谱,尤其是正相/反相二维液相色谱技术发展较为缓慢,其主要的技术瓶颈在于第一维色谱(正相)分离后的流动相严重干扰第二维色谱(反相)的分离。最近,中国科学院大连物理化学研究所的关亚风教授课题组研制出一种新型二维液相色谱接口真空辅助动态气化接口,并将其成功地用于正相/反相二维液相色谱系统。该接口设计简单,由一个真空辅助气化环组成。该气化环与真空泵相连构成真空辅助气化环境。在二维色谱过程中,正相色谱流出的流动相(有机溶剂)经过该接口时通过真空挥发除去,而分离组分能够流入第二维色谱柱。他们对该接口的工作条件进行了优化并对其性能进行了考察。研究表明,在第一维流动相流速达到1 mL/min时该接口能够有效地除去第一维流动相,而非挥发性分析物质在该接口中几乎没有损失。他们将构建的正相/反相二维液相色谱系统成功地用于原油和煤焦油复杂样品的分离分析。我们相信这种新型的正相/反相二维液相色谱系统在复杂体系分离分析如蛋白质组、天然药物和生物流体具有潜在的应用前景。详见: J Chromatogr A, 1 July 2010, doi: 10.1016/j.chroma.2010.06.053。 在多维分离中,二维凝胶电泳具有分离效率高的特点,目前仍然是蛋白质组学研究的重要手段之一。然而,由于二维凝胶电泳重现性差,分析时间长,不能自动化,远远不能满足当今蛋白质组学研究的要求。与传统的电泳技术相比,毛细管电泳具有分离效率高、样品用量少、分析时间短、能够自动化等特点,是发展多维电泳方法的理想选择。最近,美国华盛顿大学的Dovichi教授课题组对二维毛细管电泳模式进行了尝试,构建了等电点聚焦/十二烷基磺酸钠(SDS)区带毛细管电泳系统。该系统的分离模式与传统的二维凝胶电泳基本相近,第一维采用等电点聚焦分离模式, 第二维采用SDS区带电泳分离模式。在二维毛细管电泳中,蛋白质样品首先经过等电点聚焦分离后,依次进入第二维SDS区带电泳分离通道。 该系统第一维等电点聚焦所需时间约为420 s,在第二维分离中每一馏分样品转移时间为6 s,分离时间为180 s。与传统的二维凝胶电泳相比,二维毛细管电泳方法显著地减少了分析时间和样品用量。他们以荧光标记蛋白质为模型样品,采用激光诱导荧光检测方法对该系统性能进行了考察,获得的峰容量为125。虽然目前该二维分离系统的峰容量远低于传统的二维凝胶电泳,但是我们相信二维毛细管电泳技术应该代表着多维电泳未来的发展方向。详见: Electrophoresis, 5 July 2010, doi: 10.1002/elps.201000151。 2基于癌细胞膜的亲和色谱药物筛选 将生物分子(如酶、辅酶、抗体、抗原等)为配体固载于担体(如二氧化硅)的表面构成的亲和色谱固定相已被广泛地用于生物分子的相互作用和药物的筛选。最近,西安交通大学的贺浪冲教授课题组以细胞膜为配体,制备了一种新型的亲和色谱固定相,成功地用于天然抗癌药物有效成分的筛选。他们所用的细胞膜来自于人的皮肤鳞癌细胞 (human epidermal squamous cells, A431)。该细胞膜中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)呈现过表达现象。EGFR是一种相对分子质量为170000的跨膜糖蛋白,它对调节肿瘤细胞生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移具有重要的作用,在大多数肿瘤细胞(如乳腺癌、宫颈癌,肺癌、前列腺癌等)中呈现过表达,已经成为肿瘤治疗和抗肿瘤药物筛选的潜在靶点。该细胞膜亲和色谱原理就是基于EGFR与某些物质(如药物分子)的相互作用。 他们首先提取A431细胞膜,通过吸附作用将细胞膜固载于硅胶载体表面构成亲和色谱固定相,然后构建了基于二维液相色谱的药物筛选系统。在该系统中,第一维采用的是细胞膜亲和色谱模式,第二维采用的是反相色谱模式,紫外吸收和质谱方法分别用于各维的检测。他们将该二维液相色谱系统用于苦参萃取液中抗癌有效成分的筛选,其结果与传统的细胞培养筛选的结果基本一致。与传统的方法相比,细胞膜亲和色谱方法具有样品用量少、分析时间短、能够自动化、同时能对筛选的靶标分子进行鉴定等特点,将在新药的筛选方面有潜在的应用前景。详见: J Chromatogr A, 19 June 2010,doi: 10.1016/j.chroma.2010.06.037。 3动物组织在线液相萃取直接进样的液相色谱系统 在新药物筛选以及临床药代动力学研究过程中,全身放射自显影技术目前是用来检测药物在给药动物体内分布状况的常用方法。然而,全身放射自显影方法不能区分检测药物和它们的代谢产物。最近,美国橡树岭国家实验室的两位科研人员Kertesz和Berkel对液相色谱商品化自动进样器进行改进,构建了一种在线液相萃取表面进样系统,并成功地用于液相色谱/电喷雾离子化质谱联用系统,实现了对小鼠全身组织萃取液中药物和它们的代谢产物的分离检测。该进样系统设计简单,通过一个微型接口将一个普通注射器与自动进样器连接以实现液滴萃取模式。在实际操作时,首先将注射器中萃取剂的液滴与动物组织表面接触实现液相萃取,然后由自动进样器将萃取的样品送入液相色谱/质谱系统。他们以对剂量组和对照组小鼠整体薄层组织切片的4个不同器官(脑、肺、肾和肝脏)中药物心得安 (propranolol)的检测为例,阐明了基于在线液相萃取表面进样的分离技术联用系统的有效性。他们在剂量组小鼠的4个器官中均可检测到药物心得安,另外在肺、肾和肝脏还检测到药物心得安的两个同分异构体代谢物。实验结果与常规的离线萃取进样-液相色谱/质谱方法结果相当。该方法能够对药物在动物体内的分布状况和代谢过程进行有效的检测。通过在线液相萃取实现薄层组织切片表面进样及其与液相色谱分离分析联用扩展了液相色谱/质谱的应用范围。这一方法为新药物筛选提供了一种有效的手段。详见: Anal Chem, 18 June 2010, doi: 10.1021/ac100954p。     

亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱法鉴定水稻蛋白质

建立了亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质组学的方法。利用标准肽段系统分析了液相色谱流动相酸碱度对二维亲水作用-反相色谱系统正交性的影响。结果表明,第一维亲水作用色谱在碱性(pH 9.3)和第二维反相色谱在酸性(pH 3.3)的条件下,正交性最佳(R~2=0.34113)。在此基础上,结合馏分收集技术进一步评价了本测试系统在水稻叶片蛋白质分析中的正交性。结果表明,在所有馏分收集组分中,鉴定次数小于2次的水稻叶片肽段占总肽段数目的 50%以上,且一维液相色谱馏分收集的肽段在第二维色谱及质谱分离分析中,可以较好地分布在不同时间段的洗脱窗口,表明本研究建立的亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱结合馏分收集技术在复杂水稻叶片蛋白质分离鉴定中可提供良好的的分离正交性。结合水稻蛋白质数据库检索,共鉴定出207345个肽段,归属于2930个蛋白质簇。     

二维高效液相色谱技术用于分析中药制剂中麻黄类生物碱

构建了一个离线的二维高效液相色谱系统,以解决成分复杂的中药样品的分离和痕量组分的定量问题。该系统在原有的单泵、单检测器高效液相色谱仪的基础上作了相应的改进而构成,样品先在第一维的Zor-bax SB-C18色谱柱中进行分离之后,利用一个六通切换阀将目标组分切换并收集,浓缩后再注入第二维的Ai-chrom Bond-AQ C18色谱柱中进行分离。利用上述方法对3种麻黄类生物碱进行了二维分离和分析,实验结果表明,样品的分离明显改善,并且这个系统可用于中药的直接进样分析。     

凝胶过滤/离子交换全二维液相色谱系统的构建与评价

基于蛋白质的尺寸及带电性质,将凝胶过滤色谱(GFC)与离子交换色谱(IEC)两种分离模式结合,采用双捕集柱接口构建了GFC/2×IEC二维液相色谱(2-D LC)分离系统,同时考虑离子交换色谱分离蛋白质对等电点范围的限制,进一步结合中心切割平行柱的方法实现对蛋白质的全二维分离。为与后续蛋白质在线酶解、多肽分离及质谱鉴定匹配,系统中采用常规柱以保证蛋白质质谱鉴定对样品量的要求,3种常规分离柱分别选用凝胶过滤色谱柱TSK-GEL G3000SW_(XL)(300 mm×7.8 mm,5μm)、强阴离子交换色谱柱Hypersil SAX(100 mm×4.6 mm,10μm)和强阳离子交换色谱柱Hypersil SCX(100 mm×4.6 mm,10μm)。最终以酵母细胞蛋白质提取液为样品,对构建的二维系统加以评价,在总蛋白质浓度13.5 mg/mL、上样体积100μL的条件下,将第一维分离等时间切割17次,并将切割馏分全部导入第二维继续分离,二维系统在148 min内获得的总峰容量达到884。说明所构建的系统可以用于蛋白质的在线全二维分离。     

去除血浆中高丰度蛋白质的二维液相色谱体系的建立

血浆中高丰度蛋白质的存在严重干扰低丰度蛋白质的检测,是困扰血浆蛋白质组学研究的技术瓶颈之一。针对这一热点问题,建立了一种二维液相色谱(强阴离子交换色谱-反相高效液相色谱)分离系统,对血浆中的高丰度蛋白质进行了色谱定位并进行去除。选择TSKgel SuperQ-5PW为第一维色谱分离柱,第二维色谱分离采用Jupiter C4柱,对第一维的馏分进行进一步的分离。通过梯度优化,血浆样品经过二维系统得到充分分离。第二维分离过程中从紫外信号强度高(215 nm,大于20 mAU)的峰中选择10个峰,利用液相色谱-串联质谱鉴定出32种高丰度蛋白质,包括人血清白蛋白、免疫球蛋白G等高丰度蛋白质。该体系为血浆中更多高丰度蛋白质的去除以及血浆蛋白质组学的更深入研究提供了重要思路。     

离线二维反相液相色谱/超临界流体色谱在瓜蒌子分离中的应用

发展了离线二维反相液相色谱/超临界流体色谱(2D RPLC/SFC)分离瓜蒌子的方法。实验在第一维采用反相色谱,按色谱峰收集从瓜蒌子样品中制备得到的12个组分(F_1~F_(12)),并将得到的组分在第二维使用SFC分离。这些组分在RPLC和SFC的分离对比说明,该二维方法具有良好的分离正交性,可至少检测到150个色谱峰,对于解决结构相似物质的分离、微量成分的富集表现出了明显的优势。SFC方法采用了乙醇-正己烷(3∶7,v/v)的混合溶剂作为改性剂,既提供了适当的洗脱能力,也保证了在上样量增加时满足样品溶解的要求。此二维分离体系可放大到制备水平用于化合物的制备,为瓜蒌子化学成分的纯化制备提供技术支持,为其物质基础研究提供参考。     

二维液相色谱接口技术

二维液相色谱具有峰容量大、分辨率高、分析速度快等优点,已经成为复杂样品分离分析的重要工具。两种分离模式的转换通常需要经过一个特殊接口来完成,接口是二维液相色谱系统的核心,也是限制二维液相色谱应用的瓶颈;两种流动相不互溶时,接口尤为重要。本文针对二维液相色谱接口技术近期的发展和应用进行总结。引用文献51篇。     

新型全二维微柱液相色谱分离平台的构建

采用自动进样器和一套二元梯度泵构建了以阳离子交换色谱-反相色谱(SCX-RPLC)为分离模式的新型全二维微柱液相色谱分离平台.在第一维分离中,通过自动进样器将不同浓度的盐溶液以台阶梯度输送至SCX柱上,实现肽段的分级洗脱.洗脱下的肽段经C8预柱富集、除盐后,进入第二维C18 RPLC柱上,通过线性梯度实现进一步的分离.采用该平台分离了5种标准蛋白的酶解产物,系统峰容量可达1 467.结果表明,该平台可以自动完成进样、除盐、分离及检测.     

蛋白质高效分离两维色谱柱的选择优化

为了构建高效的离子交换/反相二维液相色谱(IEC/RPLC)分离平台系统,提高复杂蛋白质样品的分离效率,对色谱柱进行了评价与筛选。通过对实际人肝蛋白质样品的分离效果的比较,选择确定了TSKgel DEAE-5PW弱阴离子交换色谱柱(WAX)作为第一维色谱分离柱;考察了同一规格的10支代表性反相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 30 nm, C4、C8或C18),通过评价其对尿嘧啶、硝基苯、萘和芴的分离性能以及对3种标准蛋白质样品的非特异性吸附、对人肝蛋白质样品的WAX馏分的分离效果,最终确定以Jupiter 300 C4反相色谱柱作为第二维色谱分离柱。对两维色谱柱的选择优化为蛋白质高效分离二维液相色谱平台的搭建提供了可靠基础。     

在线单柱二维液相色谱法快速纯化牛胰腺中细胞色素C

用二维（弱阳,疏水）色谱柱首次完成了在线单柱二维液相色谱法快速纯化牛胰腺中的细胞色素C.在将牛胰腺粗提液进样到该二维色谱柱后,在弱阳离子交换模式下,以梯度洗脱方式进行一维色谱分离,并将分离得到的细胞色素C样品液收集到色谱仪的附加样品储液管内.然后将储液管中样品液全部排出,并二次进样到同一根二维色谱柱中,与此同时也完成了对该样品液的缓冲溶液交换,按疏水色谱（HIC）分离模式进行分离.最终对细胞色素C完成了第二维的HIC纯化.上述全部操作均为在线,在一具有正压的封闭体系中进行并可在52分钟内完成.细胞色素C的最终产品纯度高达94.7%（RSD=1.91%）,质量回收率为80.5%（RSD=2.20%）.预计此在线单柱二维液相色谱法也可能用于牛胰腺中其他功能蛋白的快速纯化,并可能将其放大到制备和生产规模.