基于核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的荧光适配体传感器用于卡那霉素的检测

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(CNPs)的信号放大体系用于卡那霉素(KAN)检测的新方法。合成了水溶性的CNPs,并设计合成了不同序列的DNA,具体包括:卡那霉素适配体(Apt),羧基荧光素标记的信号DNA探针(FAM-DNA)和互补链cDNA。当体系中不存在KAN时,Apt与cDNA可以杂交形成双链DNA,体系中FAM-DNA处于单链状态,Exo Ⅲ不能水解单链DNA;此时,体系中加入CNPs,单链FAM-DNA被CNPs吸附,荧光发生淬灭;在KAN存在下,Apt与其靶标KAN特异性结合,此时FAM-DNA与cDNA杂交形成双链DNA,由于CNPs对双链DNA吸附较弱,DNA探针的荧光不发生淬灭。ExoⅢ可以特异性的从3’-端对FAM-DNA降解,释放FAM荧光团和cDNA,该体系通过"降解-杂交"循环,最终释放出大量的FAM荧光团。由于CNPs对FAM具有较低的亲和力,释放出的FAM不能吸附在CNPs表面,FAM荧光不会发生淬灭,实现荧光信号放大扩增作用。方法线性范围为50～100 nmol/L,检测限为2.5 nmol/L。该方法可用于实际样品牛奶中卡那霉素的检测。     

基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测

设计合成了一种长臂发夹型核酸探针,结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法.当不存在靶DNA时,SYBR GreenⅠ荧光染料能够嵌入发夹型探针的茎部而发出很强的荧光,而当存在靶DNA并与发夹型探针杂交后,核酸外切酶Ⅲ从杂交产物的3'端开始水解发夹型探针,释放出靶DNA,并触发下一个酶水解反应,同时SYBR GreenⅠ染料也随发夹型探针水解而释放,导致荧光信号降低,从而实现了对DNA的免标记荧光信号放大高灵敏检测.该方法的检出限低至320 fmol/L,比传统双标的分子信标的方法降低了4~5个数量级,且该方法还具有免标记、简单、快速的特点.     

基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的荧光法检测四环素

以核酸适配体作为识别单元、核酸外切酶Ⅲ(EXO Ⅲ)作为信号放大元件以及氧化石墨烯(GO)作为信号开关的荧光传感器来检测四环素(TC)。当体系中没有TC存在时,四环素适配体与其互补链(c DNA)杂交形成双链,EXO Ⅲ不能切割5'端标记有荧光基团的单链信号链(SP),加入GO后,信号链被吸附至GO表面并发生荧光淬灭。当体系中有TC存在时,核酸适配体能够识别并且结合TC,促使c DNA与SP链形成双链,这将诱导EXO Ⅲ从信号链3'端对c DNA-SP双链进行切割,释放出荧光基团,游离的荧光基团不能被GO吸附而淬灭,通过连续的酶促切割,得到更多的游离荧光基团,从而使得荧光信号明显增强。建立的荧光法对TC具有较高选择性,检测限(LOD)为671 pmol/L,方法已用于自来水样品中TC的测定。     

基于核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大与MoS2纳米片荧光碎灭性质的核酸检测方法

将核酸外切酶Ⅲ诱导的双重信号放大技术与MoS2纳米片的荧光猝灭性质结合,构建了一种高灵敏高选择性的DNA检测方法.首先设计两条末端修饰荧光基团的探针核酸(HP1和HP2).由于两条探针核酸具有3'粘性末端,使其不会被核酸外切酶Ⅲ降解,因而被吸附于MoS2纳米片而猝灭其荧光.当目标DNA存在时,会促使核酸外切酶Ⅲ启动双重信号放大反应,并将探针核酸降解成大量的不能吸附于MoS2纳米片表面的荧光碎片.在优化条件下,目标DNA浓度在0.5~6.0 pmol/L范围内与荧光信号变化呈良好的线性关系,检出限为0.28 pmol/L.与单重信号放大技术相比,本方法极大改善了分析灵敏度和检出限,且具有良好的单碱基错配区分能力.     

基于核酸外切酶Ⅲ及DNAzyme的铅离子荧光传感器的研究

利用DNAzyme及核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)构建了荧光生物传感器用于检测铅离子(Pb²⁺)。DNAzyme与底物探针结合并在Pb²⁺辅助作用下切割底物,使发夹结构的底物探针在环上修饰有RNA碱基处断裂,切割断裂底物探针后,DNAzyme被释放,继续与下一个底物探针结合并切割,利用DNAzyme可循环反复催化裂解底物的特性实现循环反应。底物探针被切割断裂后,形成的Y字形探针可与信标探针结合并打开其发夹结构,产生荧光信号,同时在ExoⅢ的作用下降解,从3′端开始切割水解被打开的信标探针,释放出底物探针,继续与下一个信标探针结合切割,形成第二步的循环信号放大。经过两步的循环反应,荧光信号得到不断增强,从而达到高灵敏检测的目的。200μL反应体系在37℃反应60 min后,其荧光信号与Pb²⁺浓度在0.05～200 nmol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为0.01 nmol/L。用于实际样品中Pb²⁺的检测,加标回收率为96.3%～108.3%。本方法具有简单、快速、高选择性、高灵敏的特点,在Pb     

基于石墨烯猝灭及核酸外切酶辅助循环放大适体传感器检测ATP

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助分析物循环放大原理,结合石墨烯(G)的超高荧光猝灭能力,以三磷酸腺苷(ATP)作为模型分析物,构建了一种新型的荧光探针,实现了ATP的高灵敏检测。两条DNA链各包含一部分ATP适体序列,其中1条DNA链的3'端修饰有荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)。当模型分析物不存在时,两条DNA链通过非共价π-π堆积作用吸附在G表面,导致FITC的荧光猝灭。当目标物ATP存在时,两条DNA链与目标物ATP进行特异性结合,形成一双链夹心结构,随后加入ExoⅢ,由于ExoⅢ可对该双链夹心结构的3'凹陷末端进行逐步水解,释放出目标物ATP和游离的FITC。释放出的目标物ATP可继续进入下一循环,不断产生游离FITC,游离FITC将脱离G表面,从而导致体系的荧光恢复,并且恢复的荧光强度与ATP浓度在0.02~1μmol/L范围内存在良好的线性关系,检出限(S/N=3)为9 nmol/L。     

基于核酸外切酶Ⅰ辅助目标物循环放大策略的非标记适配体荧光传感器检测土霉素

建立了基于核酸适配体的特异性识别和核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ)辅助目标物循环放大的非标记荧光检测方法,用于土霉素的定量测定.体系中无土霉素时,SYBR Green I(SGI)分子可以插入土霉素适配体与其互补链形成的双链DNA(dsDNA)中,并在495 nm光激发下产生强烈的荧光发射.在土霉素存在时,由于核酸适配体与土霉...     

基于核酸外切酶Ⅲ和G-四链体无标记检测Pb~(2+)的荧光传感器

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的水解特性以及Pb~(2+)诱导富含G碱基的DNA(G-DNA)形成G-四链体结构的特点,以荧光染料SYBR GreenⅠ(SGⅠ)为信号探针,一端带有3'凸末端的线性双链DNA(G-dsDNA)为识别探针,建立了一种新型无标记检测环境样品中Pb~(2+)的荧光传感方法。研究了不同浓度Pb~(2+)引起体系荧光强度变化的规律,考察了SGⅠ、ExoⅢ的浓度、溶液pH以及稳定时间等因素对检测灵敏度的影响。结果表明:在优化的实验条件下,Pb~(2+)浓度在2.0～50.0 nmol/L范围内与体系荧光强度的变化呈良好的线性关系,检出限为0.7 nmol/L。常见金属离子对Pb~(2+)的检测无明显干扰,方法具有良好的选择性。     

基于核酸外切酶Ⅰ的适配体荧光传感器检测人尿液中的Hg2+

基于富含胸腺嘧啶(T)DNA适配体对Hg2+的特异性识别和核酸外切酶I(Exo Ⅰ)辅助的信号转换策略,建立了快速检测人尿液中Hg2+的荧光分析方法.固定在微孔板上的DNA适配体特异识别Hg2+后,折叠成稳定的发卡型双链结构,不能被单链特异性的Exo Ⅰ水解,核酸染料SYBR GreenⅠ(SG)插入发卡部位产生荧光信号,基于此可实现Hg2+的定量检测.优化后的最佳实验条件为:微孔板包被亲和素浓度为50 mg/L;检测DNA包被浓度为75 nmol/L;使用5×SG以及1.2 μL的Exo Ⅰ.在最佳实验条件下,体系荧光强度与Hg2+浓度的对数呈良好线性关系,线性范围为2～500 nmol/L,检出限为1.5 nmoL/L(3σ).利用本方法检测尿样中的Hg2+,加标回收率为91.2％ ～ 95.0％,相对标准偏差(n=5)为2.1％ ～4.6％.本方法选择性良好,操作简单,用HNO3-KMnO4溶液将尿液中其它形式的汞氧化为Hg2+后,成功实现了尿液中总汞含量的检测.     

基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法

利用茎环结构定位探针构建了一个基于双酶切反应的级联信号放大体系,并将其用于核酸的检测.在该体系中,茎环结构定位探针首先是内切酶Tth EndonucleaseⅣ的作用底物,被剪切后又作为定位探针介导切口酶Nt.Bst NBI对分子信标实施剪切,将这2步剪切反应结合起来可有效克服切口酶对于目标核酸中特定识别序列的依赖,同时进一步提高了检测灵敏度.实验结果表明,荧光信号与目标DNA浓度的对数值呈线性相关,响应范围为1 pmol/L～1 nmol/L,并且具有良好的识别单碱基变异的能力.此外,本方法序列设计简单,通用性强,仅改变定位探针的部分序列即可实现对不同目标DNA的检测.对掺杂于血清中的目标DNA的检测结果验证了本方法在实际样品检测中的应用潜力.     

基于双发射免标记核酸探针的比率型荧光传感器用于银的检测

构建了一种新型免标记的双发射荧光比率核酸探针(GelRed/[G40]/Tb^3+)并用于Ag+的检测。对于GelRed/[G40]/Tb^3+探针,GelRed作为一种核酸染料嵌入到单链DNA-[G40]中,形成的GelRed/[G40]作为稳定的内置参照标准,在激发波长290 nm处,发射荧光强度固定不变的红色荧光(发射波长为635 nm),而[G40]/Tb^3+作为敏感的响应信号,随着Ag^+浓度的增加,产生的绿色荧光逐渐增强(发射波长为545 nm),[G40]/Tb3+与GelRed/[G40]发射的荧光强度比值也发生相应的改变,从而实现对Ag^+的定量检测。在优化的实验条件下,[G40]/Tb^3+与GelRed/[G40]荧光强度比值和Ag^+浓度在0~7.5μmol/L的范围内具有较好的线性关系,Ag^+检出限为0.156μmol/L。本传感器在10 min内就可完成对Ag^+的分析。方法已用于自来水样中Ag^+的检测,与ICP-MS法检测结果一致。     

核酸外切酶Ⅲ辅助的DNA铽离子配合物时间分辨荧光检测黄曲霉毒素B1

基于适配体的高特异性识别能力,结合核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助的核酸信号放大策略和时间分辨荧光测量技术,构建了无标记、超灵敏的适配体荧光生物传感器(Aptasensor),用于检测黄曲霉毒素B1(AFB1).设计了两个无标记的功能核酸发夹,其中,含有AFB1适体序列的发卡H1作为识别元件,茎部含有富G序列的发卡H2作为...     

基于核酸外切酶Ⅰ催化的核酸降解反应构建乳腺癌细胞电化学传感器

基于核酸外切酶I选择性消化单链核酸的特点,使用MCF-7细胞表面过量表达的肿瘤标志蛋白MUC1的适体,构建了一种灵敏检测乳腺癌细胞的新型电化学传感器。核酸适体链与乳腺癌细胞MCF-7表面过量表达的肿瘤标志蛋白MUC1的结合会阻碍其与互补核酸探针链的杂交,所以电极表面固定的未杂交的核酸探针单链就会被外切酶I选择性消化从而失去末端的亚甲基蓝信号分子。因此,通过检测电化学信号的变化,此传感器在103~106cell/mL细胞浓度范围内线性检测乳腺癌细胞MCF-7,检出限为330 cell/mL,具有高度特异性,可以有效区分对照细胞胰岛β细胞。     

酶联放大安培检测基因传感器的封闭方式

在酶联放大安培检测过程中,酶和碱基链在金电极表面的非特异吸附是导致假阳性结果的主要来源.为减少非特异吸附,分别从封闭时间和封闭方式等考查巯基己醇(MCH)和牛血清白蛋白(BSA)对上述非特异性吸附因素的封闭效果.结果表明,BSA不论是对酶还是碱基链的封闭效果均优于MCH.经优化,确定BSA单一封闭剂(15min)为最佳封闭条件,并可用于急性早幼粒细胞白血病(PML-RARα)融合基因的检测.本方法可有效减少非特异吸附,缩短检测预处理时间,并使检测信号在一定程度上得到放大.     

5'核酸外切酶特异性荧光探针的设计和应用

根据5'核酸外切酶与底物间相互作用的特点,设计开发了对其具有高选择性、高灵敏度的DNA荧光探针。该探针对5'外切酶的线性响应范围为0.005~0.1 U/m L,检测限为0.005 U/m L。方法可用于人血清样品中5'外切酶的一步快速测定,测得正常人血清中5'外切酶的含量为0.09±0.01 U/m L,回收率为100%±5%(n=3)。该研究为实时监测生物样品中5'核酸外切酶的含量变化提供了有力的工具,也将有助于深入研究核酸损伤的修复途径。     

无标记型核酸适体荧光传感器检测氯霉素的含量

建立了DNA核酸适体检测氯霉素的荧光分析新方法。将前人筛选得到的80bp的氯霉素DNA核酸适体截短至40bp,实验发现截短并不影响核酸适体与氯霉素的结合能力。40bp的DNA核酸适体与另一条互补DNA链形成双链DNA,SYBR Green I荧光染料能插入双链并有强荧光发射,加入氯霉素后,氯霉素能和DNA核酸适体形成稳定的复合物,诱导DNA双链打开,SYBR Green I释放,荧光降低。实验结果显示:在10~200μmol/L范围内,荧光降低百分数和氯霉素之间有良好线性关系,检测限为6μmol/L。