L-乳酸脱氢酶催化反应机理的理论研究进展

介绍Ｌ－乳酸脱氢酶可逆催化氧化Ｌ－乳酸生成丙酮酸的反应机理研究的最新进展。讨论底物及活性中心附近残基的构型对反应的影响以及Ｈ－离子转移的可能机理。     

L-乳酸脱氢酶抑制剂抑制成因的探讨

应用HF/3 21G研究了抑制剂H2N－CO－COO－对L 乳酸脱氢酶的抑制成因.结果表明,酶被抑制的主要原因有:(1)抑制剂与底物的稳定构象态在结构上极为相似,导致酶不能有效识别底物;(2)模型抑制剂各原子所带净电荷的优势使抑制剂更易与酶活性中心结合;(3)抑制剂通过对酶的诱导契合作用使酶活性中心的空间被缩小;(4)对活性中心有关结构的分析表明,底物的甲基分子片以及酶的氨基酸残基Gln 102,对催化反应能否顺利进行,影响极大.     

L-乳酸脱氢酶催化反应机理的ab initio研究

应用ab initio方法在HF/6-31G*水平上对L-乳酸脱氢酶催化反应机理进行了研究.结果表明,H_R^-的转移是丙酮酸盐转化为L-乳酸盐反应的速度控制步骤,并且,H_R^-与H_R⁺的转移是准同步进行的.反应的活化能为168.37 kJ/mol,反应物的复合物与产物复合物的能量差为?87.61 kJ/mol,丙酮酸转变为乳酸是吸热反应.与文献报道的半经验研究相比,计算结果的显著特征是:过渡态中辅酶上的吡啶环呈准船式构象而非平面构象;反应的H_R⁺转移步骤在结构及电荷特征上与低位垒氢键很相似.此外,过渡态中底物与L-乳酸脱氢酶的活性位之间存在着相当强的静电作用,伴随着过渡态的形成,底物上羰基的极性逐渐增强,有利于H_R^-的转移.这些计算结果与相关实验结论一致.计算结果还表明,过渡态中的“氢负离子”H_R^-实际上是一个带0.13个单位正电荷的阳离子,这一结果与文献报道的半经验计算结果一致.     

甜菜碱与藻胆蛋白超分子复合体相互作用的分子机制

甘氨酸甜菜碱是具有重要生物学意义的生物小分子,它可以保护细胞、蛋白和酶的结构功能完整性,也会导致蛋白超分子结构松散、功能钝化,这两种相反作用的分子机制尚不清楚．本文以超分子藻胆蛋白和藻胆体为模型,证明甜菜碱导致超分子藻胆体结构松散、各组份能量失耦合,最敏感的作用位点是核．膜连接多肽,其次是杆一核连接多肽．C－藻蓝蛋白三聚体与单体对甜菜碱的相应完全不同,前者结构松散而后者相对聚集．甜菜碱屏蔽静电吸引力导致结构松散但强化基元蛋白之间的疏水作用力是两种相反现象的本质,甜菜碱最终导致C－藻蓝蛋白三聚体和单体相同的光谱特征是两种机制的“折中”．     

乳酸脱氢酶反应器用于流动注射分析测定人体液中的L-乳酸

本文用[3-(2-氨乙基)氨丙基]三乙氧基硅烷试剂胺化一定孔径大小的载体,用戊二醛作偶联剂,将乳酸脱氢酶固定于其上,装入柱内,联结于流动体系中。L-乳酸的浓度在0.1～4.4mmol/L呈线性,检测限为0.4nmol(s/N=4),相对标准偏差≤1.2％,回收率在96％～103％。每小时进样35次。测定了固定化LDH的表观米氏常数及人血清和尿中的L-乳酸。     

基于可见吸收信号的乳酸脱氢酶光纤传感器

报道一种测定乳酸脱氢酶活力的基于可见吸收信号的光纤生物传感器，在该传感体系中，通过辅酶Ｉ的氧化还原对（ＮＡＤ＾＋／ＮＡＤＨ）将乳酸脱氢酶和心肌黄酶催化的两个脱氢过阳以耦合，第一个脱氢过程对分析对象进行了化学识别，第二个脱氢过程引起可见吸收信号的变化，该传感器对０～４００Ｕ／Ｌ的乳酸脱氢酶有线性响应关系，检测下限为４８ＵＬ，该传感器已用于人体血清中乳酸脱氢酶活力的测定。     

儿茶素与DNA分子间的相互作用机制研究

采用荧光光谱法和紫外光谱法研究了在生理酸度(pH=7.4)条件下儿茶素与DNA的作用方式.通过研究DNA与儿茶素相互作用的荧光和紫外光谱,并结合溴化乙锭荧光探针、Ⅰ￣离子效应、DNA熔点效应及盐效应等实验,探讨儿茶素与DNA的作用模式.研究结果表明儿茶素与DNA主要以嵌插方式发生结合.根据DNA对儿茶素荧光的猝灭,计算出儿茶素与DNA的结合常数为9.44×10-4L·mol-1,结合位点数为1.18.     

仿生信号转导体系的构建:囊泡表面磷脂信号分子诱发的乳酸脱氢酶的激活

以细胞肌醇磷脂信号转导途径为原型,在合成肽脂囊泡(人工细胞膜模型)上,利用天然磷脂为信号分子,成功地激活了处于囊泡表面的乳酸脱氢酶．为此,将1,2-二-十四烷基磷脂酰乙醇胺等天然磷脂嵌入合成肽脂N,N-二-十六烷基-N^a-6-三甲胺基己酰基-L-甘氨酰胺囊泡中,制备了稳定的混合双层膜囊泡,用透射电子显微照相、动态光散射及差示扫描量热等手段确认了混合囊泡的形态及粒径分布．以磷酸吡哆醛等维生素B6类化合物为信号分子激活剂,利用它们与天然磷脂形成复合体,进而与Cu^2 形成强的金属配合物的性质,实现了对处于囊泡表面、被Cu^2 抑制的乳酸脱氢酶的激活,构建了一个新的仿生信号转导体系．紫外一可见光谱实验证实了以上结果．此外,结果还表明囊泡表面的疏水作用和静电引力是促进天然磷脂一磷酸吡哆醛复合体形成的主要因素．囊泡表面的疏水微环境作为反应场是构建此仿生信号转导体系不可缺少的要素．     

稀土离子和钙调蛋白对乳酸脱氢酶活性的影响

分别研究了三价稀土离子、稀土离子和钙调蛋白(CaM)的复合物以及作为稀土离子配体的二乙三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物二乙三胺五乙酸-双二甲酰胺(DTPA-BDMA)和二乙三胺五乙酸-双(异烟肼)(DTPA-BIN)对乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响.结果表明稀土离子浓度小于3μmol@L-1时对酶活性具有轻微的激活作用,离子浓度增大到6μmo1@L-1后则开始表现出抑制作用;钙调蛋白可以缓解这种抑制作用;二乙三胺五乙酸及其衍生物在浓度超过5μmol@L-1时对酶活性均有抑制,这种抑制作用在加入外源的钙调蛋白后也得到缓解.     

ACE抑制三肽与ACE相互作用的分子机制

4种食源性三肽IRP(Ile-Arg-Pro),IKP(Ile-Lys-Pro),GRP(Gly-Arg-Pro),IRA(Ile-ArgAla)的ACE抑制活性已得到实验证实,但其与ACE的相互作用模式与分子机制尚不清楚,本研究采用柔性分子对接方法解决这一问题。分子对接结果表明:4种三肽与ACE有相似的作用模式,氢键、亲水、疏水、静电等作用力共同对三肽与ACE的结合存在贡献,但以氢键作用为主;ACE分子中Lys511,His513,Tyr520,Tyr523等氨基酸残基为其与肽结合的重要结合位点;ACE抑制三肽中氮端氨基和碳端羧基对其抑制活性影响显著,其中氮端氨基的作用更为重要。通过以上分子机理研究可为开发强活性ACE抑制肽提供理论指导。     

D-扁桃酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶级联催化的L-苯甘氨酸对映选择性生物合成

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。 本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓度的辅酶即可实现生物催化D-扁桃酸合成L-苯甘氨酸。 通过对加酶量、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)浓度、NH₄⁺浓度和底物浓度等因素进行优化,获得了一个最经济的反应条件:200 mmol/L的D-扁桃酸、6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD⁺、0.5 mol/L NH₄⁺的条件下、30 ℃,反应12 h,在此条件下,产物的得率和对映体过量(e.e.)值分别可达98%和99%以上,具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。     

纳米材料-蛋白质界面相互作用的分子机制

纳米材料由于其优异的性能在化工、电子、机械、环境、能源、航天等各个领域已经得到了广泛的应用,并且在生物医学方面的应用越来越受到重视。纳米材料-蛋白质界面相互作用是纳米生物医学领域重要的科学问题,对于纳米材料的生物医学应用以及生物安全性评价至关重要。蛋白质分子与纳米材料在界面的相互作用,一方面可以诱导蛋白质的构象、组装结构甚至功能的改变,另一方面可以引起纳米材料的表面亲疏水性、电荷性质等表面物理化学性质的改变。基于蛋白质与纳米材料相互作用检测技术及结果,本文从分子水平阐述了纳米材料与蛋白质分子在界面之间的相互作用机理及相应的结构与性质的变化,从而可以深化对两者之间复杂的相互作用机制的理解,对于推进纳米材料在生物医学的应用及健康、安全、持续发展具有重要意义。     

L-扁桃体酸脱氢酶的电化学特性

应用电化学方法研究了基础工程酶（L-扁桃体酸脱氢酶）的电化学性质,探讨了其催化机理。以聚赖氨酸为促进剂,L-扁桃体酸脱氢酶黄素微区在裂解石墨棱面（EPG,edge-palne pyrolytic praphite)电极上有两对氧化还原峰（-0.481V和-0.605V vs.SCE,Tris缓冲溶液pH7.5,扫描速度20mV/s）,显示出酶的辅基黄素单核苷酸（FMN）与电极之间的电子传递过程。在此条件,L-扁桃体酸脱氢酶黄素微区不能催化L-扁桃体酸脱氢,但用二茂铁甲酸和细胞色素C作为媒介体,能促进酶催化反应有效地进行。     

镍离子与酵母乙醇脱氢酶的相互作用

不同体系中, 金属离子与蛋白以不同的结合方式相互作用. 酵母乙醇脱氢酶是一个含锌金属酶, 它可催化乙醇脱氢为乙醛的反应. 本文应用紫外-可见光谱、荧光光谱、差示扫描量热法等技术研究了二价镍离子与酵母乙醇脱氢酶的相互作用. 镍离子与酶结合后在320 nm出现了紫外吸收带, 同时荧光光谱反映了酶的构象变化, 紫外与荧光光谱均展现了结合过程的双相动力学. 镍离子与酶的相互作用导致了酶由四聚体向二聚体的解离; 在酶热变性过程中, 镍离子增加了乙醇脱氢酶的变性温度和变性焓. 研究工作揭示了镍离子与酶相互作用复杂和深层的作用机制.     

多肽与朊蛋白相互作用研究

朊病毒病是一类累及多种动物和人类中枢神经系统退行性疾病,但至今针对这类疾病尚无有效的治疗方法.考虑到在180位的缬氨酸突变为异亮氨酸的180I突变蛋白的突变位点与朊蛋白181位的糖基化位点非常接近,其生物化学性质对朊病毒病的影响非常重要.本文针对180I突变蛋白的182-190段序列设计了KNFTK、KTDVE、EMMKE和EVVKK等四种αxyzβ型多肽.研究发现,四种多肽中只有EVVKK能稳定蛋白的构象,同时诱导β-折叠向α-螺旋的转变,而其他三种蛋白对180I的结构基本没有影响.该结论对于开发多肽药物并进一步用于临床治疗具有一定的借鉴作用.     

乳酸钴配合物与牛血清蛋白相互作用的研究

合成和表征了系列乳酸钴配合物,测定二水二乳酸钴配合物的结构,配合物中乳酸的羟基和羧基配位键平均键长分别为0.206 0(2)nm和0.206 8(2)nm。当[Co(Hlact)2(H2O)2](2)或[Co(Hlact)2(phen)].2H2O(4)配合物与牛血清白蛋白(BSA=Bovine SerumAlbumin)相互作用后,红外光谱显示乳酸或邻菲咯啉的特征吸收消失,钴离子与BSA出现新的配位,初步推定乳酸或邻菲咯啉配体被BSA中的强配体所取代。     

尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响

用计时电流法成功地研究了尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响,测定了尼古丁存在与否对乳酸脱氢酶酶促反应的初速度V0、酶促反应最大反应初速度Vm及米氏常数Km。实验结果表明尼古丁对乳酸脱氢酶的活性有很大影响,但在高浓度的NADH存在下,尼古丁对乳酸脱氢酶活性的影响将得到大大降低。     

聚L-乳酸/4,4'-二羟基二苯硫醚共混物的分子间相互作用及结晶和熔融行为

利用红外吸收光谱(FTIR)研究了聚乳酸(PLLA)/4,4'-二羟基二苯硫醚(TDP)熔融共混物的分子间相互作用,结果表明,PLLA的羰基与TDP的羟基之间形成了分子间氢键.通过差示扫描量热(DSC)研究了共混物的玻璃化转变行为及非等温结晶和熔融行为.结果表明,样品的玻璃化转变温度(Tg)随TDP含量的增加呈线性下降.共混物的熔融结晶温度(Tc)、结晶焓(ΔHc)、熔融温度(Tm)及熔融焓(ΔHm)均随TDP含量的增加呈下降趋势,而冷结晶温度的变化趋势则相反.当TDP达到40%(质量分数)时,共混物的DSC曲线既未出现结晶峰,也未出现熔融峰,表明该样品已完全成为非晶态物质.广角X射线衍射(WAXD)分析结果表明,TDP的加入未改变PLLA的晶型,但导致其晶面间距变大,晶体结构变得松散.因此共混物熔点的下降归因于分子间氢键的形成降低了PLLA分子链的运动能力及晶体的紧密程度而非晶型的改变.