噻虫嗪单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法的建立

通过化学修饰合成了噻虫嗪人工半抗原,采用碳二亚胺法将该半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,成功制备了分子结合比合理的免疫原和包被原。经过免疫原免疫6周龄Balb/c小鼠、PEG介导免疫鼠脾细胞和骨髓瘤细胞的融合和阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化,获得了效价高达1∶6.4×105的抗噻虫嗪单克隆抗体,抗体亚类为IgG1型。优化了ELISA实验条件,建立了基于单克隆抗体技术的噻虫嗪残留间接竞争ELISA方法。本方法的抑制中浓度(IC50)为0.0255mg/L,检测灵敏度(IC20)为0.0022mg/L,检出限(IC10)为0.001mg/L。除噻虫胺外,该抗体与其它噻虫嗪结构类似物无交叉反应。以自来水为基质的噻虫嗪添加回收实验显示,0.01,0.5和10.0mg/L添加水平的回收率均大于75%,且各添加水平重复测定8次的相对标准偏差均小于8%,说明所建立的间接竞争ELISA准确度高,重复性好,适合水中噻虫嗪残留的检测。     

联苯菊酯酶联免疫吸附分析方法研究

建立了定量测定联苯菊酯的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA)。利用联苯菊酯的代谢物联苯醇合成了联苯菊酯的半抗原LBc(2-甲基-3-苯基苄基氧基羰基丙酸)和LBy(2-甲基-3-苯基苯甲酸)。通过碳二亚胺法将LBc交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原(LBc-BSA),通过活泼酯法将LBc和LBy分别交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原(LBc-OVA和LBy-OVA),LBc-BSA为免疫原制备了联苯菊酯的兔抗血清,间接非竞争酶联免疫吸附分析方法测得其效价达5.12×104。通过同源异源分析,发现异源分析的灵敏度较高,对pH值、离子强度、甲醇含量等影响因素进行了研究,0.3mol/L钠离子强度的磷酸缓冲液(pH7.5)和30%的甲醇确定为联苯菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件,该方法的IC50为2.16±0.32mg/L,检出限(LDL)为0.016±0.002mg/L。对大部分拟除虫菊酯,如三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯和拟除虫菊酯的代谢物3-苯氧基苯甲酸没有明显的交叉反应。     

对硫磷化学发光酶联免疫吸附分析方法的建立和评价

建立了基于多克隆抗体的对硫磷间接竞争化学发光酶联免疫吸附分析方法(icCLEIA)。以三氯硫磷为原料,经三步取代反应合成对硫磷半抗原,通过活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原和包被抗原。经免疫新西兰大白兔,获得对硫磷抗血清。通过优化条件参数,建立了对硫磷的icCLEIA分析方法。本方法的检测线性范围为0.24～15.83!g/L;半抑制浓度IC50为1.14!g/L;检出限为0.09!g/L;对蔬菜样品和水样品的平均添加回收率为74.6%～121.0%。本方法可用于实际样品中痕量对硫磷残留检测。     

烯效唑酶联免疫吸附分析方法研究

合成了半抗原烯效唑琥珀酸半酯,分别将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了免疫抗原和包被抗原,并成功建立了水和土壤中烯效唑残留的酶联免疫吸附分析法。用免疫抗原免疫新西兰大白兔得到多克隆抗体,抗体的效价达到1.02×106。方法的线性范围为0.005～10mg/L,检出限为1.82±0.83μg/L。除烯唑醇有一定的交叉反应外,与大部分三唑类杀菌剂都没有明显的交叉反应。在水和土壤中添加不同浓度的烯效唑,回收率分别在82.40%～105.92%和92.42%～100.08%之间。     

吡虫啉的酶联免疫吸附分析方法研究

通过碳二亚胺法将吡虫啉交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原,混合酸酐法将吡虫啉交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原,免疫Balb/c小鼠,采用B细胞杂交瘤技术,经免疫、融合、筛选、克隆,得到抗吡虫啉单克隆抗体,抗体亚类为IgG1,制备的单克隆抗体效价达1×107,确定了吡虫啉酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的最佳工作条件,建立了定量测定吡虫啉的间接竞争ELISA方法。本方法的IC50为(15.12±1.28)μg/L,检出限为(1.76±0.02)μg/L。与其它吡虫啉结构类似物无交叉反应。批内相对标准偏差为4.5%;批间相对标准偏差5.1%,饮用水、重庆理工大学地下水和重庆市花溪河地表水平均添加回收率分别为102%,97%和85%。本研究建立了一种快速检测环境水中吡虫啉残留的方法。     

人工雌激素己烯雌酚酶联免疫分析方法的建立

本实验旨在初步建立人工合成雌激素己烯雌酚（DES）的酶联免疫吸附分析（icELISA）方法。实验首先合成了己烯雌酚的两种半抗原正丁酸己烯雌酚单醚（DES-CP）、乙酸己烯雌酚单醚（DES-CME）。DES-CP与牛血清蛋白（BSA）偶联作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠并进一步制备了DES单克隆抗体，表征了单克隆抗体的亲和力和特异性。在ELISA优化的条件下，方法的抑制中浓度为 IC₅₀＝9.8 ng/mL，检测限 IC₂₀＝2.3 ng/mL，工作浓度范围为 2-42 ng/mL. 抗体与己烷雌酚、双烯雌酚的交叉反应分别为 44%, 27%，与天然雌激素雌二醇的交叉反应小于0.1%. 评估了分析缓冲液中盐离子浓度、pH、有机溶剂含量等因素对分析方法的影响。本分析方法应用于水样的添加实验，回收率符合分析精度要求。HPLC法对实验结果进行了确证，证明了ELISA应用于水样分析的可靠性。     

呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法

本研究针对呋喃唑酮代谢物(AOZ),设计合成了系列半抗原,进一步通过偶联牛血清白蛋白(BSA)免疫Balb/c小鼠、细胞融合、筛选和亚克隆等过程成功获得了源于新颖半抗原H3的具有高亲和力(亲和力常数6.68× 1010L/mol)和高特异性(与其它功能类似物交叉反应小于0.1％)抗AOZ单克隆抗体.同时,基于设计合成的系列同/异源半抗原/包被抗原,考察了不同结构包被原对ELISA方法灵敏度的影响.另外,采用最佳的特征结构异源包被原H5 -OVA,建立了以对硝基苯甲醛(p-NP)为衍生剂的AOZ间接竞争ELISA(icELISA)和直接竞争ELISA(deELISA)检测方法.结果表明:icELISA模式的AOZ检测IC50为0.503 μg/L,定量检测线性范围(IC20～IG80)为0.06～14.0 μg/L,检出限(IC10)达0.017 μg/L; dcELISA模式的AOZ检测IC50为1.19 μg/L,定量检测线性范围为0.14～23.6 μg/L,检出限为0.056 μg/L.两种方法对AOZ的检测灵敏度和定量线性范围均达到相关检测限量要求,可满足不同需求的实际样品检测.     

头孢噻呋人工牛血清抗原的合成与原子力显微镜鉴定

采用N-羟基琥珀酰亚胺与双环己基碳酰二亚酰胺联用的方法将兽药头孢噻呋与牛血清白蛋白偶联,得到头孢噻呋人工牛血清抗原.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE)、电喷雾质谱( ESI MS)证实头孢噻呋人工牛血清抗原合成成功,计算得到头孢噻呋与牛血清蛋白的结合比约为8,并首次尝试将原子力显微镜(AFM...     

精恶唑禾草灵酶联免疫吸附分析方法研究

建立了测定精恶唑禾草灵的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA),合成了精恶唑禾草灵的半抗原精恶唑禾草酸(hapten).通过碳二亚胺法将精恶唑禾草酸交联于牛血清蛋白(BSA)作为免疫抗原,通过活泼酯法将精恶唑禾草酸交联于卵清蛋白(OVA)作为包被抗原,Hapten-BSA为免疫原制备了精恶唑禾草灵的兔抗血清,间接非竞争酶联免疫吸附分析方法测得其效价达1.024×105.确定了0.3 mol/L Na+强度的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)和10%的甲醇为精恶唑禾草灵间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件.本方法的IC50为(0.084±0.012)mg/L,检出限(IC10)为(0.0064±0.002)mg/L.对大部分芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂,如精喹禾灵、氰氟草酯、高效吡氟甲禾灵没有明显的交叉反应,对于恶唑酰草胺有一定的交叉反应,这与两者的结构有关.     

氨基甲酸酯类杀虫剂速灭威酶联免疫吸附分析方法研究

利用间-甲酚和β-丙氨酸合成了速灭威半抗原β-(间-甲基苯氧基羰基)氨基丙酸(HOM)。通过活泼酯法将HOM交联于牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上;HOM-BSA为免疫原制备了速灭威的兔抗血清,ELISA法测得其效价高达1.28×106,交叉反应测定表明抗体方法特异性识别速灭威。对离子强度等影响因素进行了研究,确定了速灭威酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的最佳工作条件,建立了定量测定速灭威的间接竞争ELISA方法,结果表明,该方法检测线性范围为1~10000μg/L;IC50为40.74μg/L;检出限为0.08~0.10μg/L;批内相对标准偏差为2.9%;批间相对标准偏差4.6%。土壤、稻谷和水中的平均添加回收率分别为80%、93.4%和107%。本研究建立了一种快速检测环境和农产品中速灭威残留的有效方法。     

精吡氟禾草灵酶联免疫吸附分析方法研究

建立了定量测定精吡氟禾草灵的间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA)。将精吡氟禾草灵在碱性条件下水解制得半抗原,再将半抗原与蛋白质偶联形成抗原后免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体。对其进行条件优化后,得到了精吡氟禾草灵的ic-ELISA方法的标准曲线。该方法的Ic50为0.553mg/L。检出限为0.0062mg/L。方法对其他芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂没有明显交叉反应。精吡氟禾草灵在样品中的回收率为86.80%～103.41%,变异系数为3.96%～12.32%。表明本研究建立的精吡氟禾草灵的ELISA方法符合农药残留分析的要求。     

细交链孢菌酮酸酶联免疫吸附分析方法研究

采用水合肼和乙醛酸依次对细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)进行衍生化,设计合成了含有氮杂共轭双键偶联手臂,可增强免疫效果的半抗原TeAHGA.通过偶联载体蛋白BSA后的免疫原TeAHGABSA免疫新西兰大白兔,成功制备了特异性识别TeA水合肼衍生物TeAH的多克隆抗体;优化确立了ELISA最佳反应条件(TeAH-OVA为异源包被原、包被浓度0.156 μg/L、药物稀释及反应缓冲液为PBS、一抗反应时间40 min、二抗反应时间20 min),建立了TeA间接竞争ELISA(icELISA)检测方法,其抑制中浓度(IC50)为1.61 μg/L,检出限(LOD)为0.08 μg/L,定量线性检测范围为0.19～12.89 μg/L (IC20～IC80).番茄、面粉样品平均添加回收率分别为67.2％～89.8％和74.8％～93.7％.     

赭曲霉毒素A模拟抗原表位及噬菌体展示酶联免疫吸附分析法的建立

以驴抗鼠二抗包被微孔板,以捕获方式包被抗赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体,利用噬菌体随机七肽库筛选OTA模拟抗原表位,并以其替代检测抗原,建立了基于噬菌体展示技术的酶联免疫吸附分析(Phage ELISA)检测OTA的方法.结果表明,筛选获得的模拟OTA抗原表位七肽氨基酸序列为GMSWMMA.基于模拟表位噬菌体建立的Phage ELISA方法半数抑制浓度(IC50值)为(0.15±0.02) ng/mL,检测OTA的线性范围为0.03～ 0.50 ng/mL,OTA的检出限为0.03 ng/mL,且Phage ELISA与其它4种常见真菌毒素(黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及玉米赤霉烯酮)无交叉反应.大米样品OTA加标实验表明,批内加标回收率为97.0％ ～ 115.2％,批间加标回收率为107.2％ ～ 123.1％,与ELISA试剂盒检测结果比较,无显著性差异.     

受体分析结合酶联免疫检测牛乳中的头孢噻呋残留

利用源于肺炎链球菌的青霉素结合蛋白PBP 2x对β-内酰胺类抗生素具有高度亲和力的性质, 提出了一种受体分析结合酶联免疫快速检测牛乳中头孢噻呋残留的新方法. 在样品中残留的β-内酰胺类抗生素只有头孢噻呋的前题下, 该法可作为定量筛选方法. 对牛乳中头孢噻呋的检测极限可达到欧盟规定最大残留量的1/5, 并且不需要烦琐的样品预处理. 给出了头孢噻呋残留检测的标准曲线, 可用于快速定量分析.     

S,S-氰戊菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法研究

合成了S,S-氰戊菊酯的半抗原S-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸-α-S-(N-丁酸基)-甲酰氨-(3-苯氧基)苄酯(Efvb).半抗原通过混合酸酐法与卵清蛋白(OVA)偶联作为包被抗原,活泼酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联作为免疫抗原.用免疫抗原免疫新西兰大白兔,得到抗S,S-氰戊菊酯多克隆抗体.通过异源分析及检测条件优化,确立了间接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件为pH 7.4,0.4 mol/L Na+、40％甲醇-PBS溶液,建立了S,S-氰戊菊酯酶联免疫分析方法.方法的抑制中浓度(IC50)值为(3.16±0.01)mg/L;检出限(IC10)为(0.0053±0.0012) mg/L.对甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯及其代谢物戊菊酸没有明显交叉反应.在自来水、河水和土壤样品中添加S,S-氰戊菊酯,其回收率分别为82.3％～108.2％,83.1％～109.2％和72.0％～91.2％.     

细交链格孢菌酮酸化学发光酶联免疫吸附分析方法

采用自制的抗细交链格孢菌酮酸(TA)多克隆抗体,建立了以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢为发光体系的间接竞争化学发光酶联免疫分析方法定量检测谷物中TA毒素。通过研究选择最佳工作参数:反应缓冲液pH 6.4~7.4、包被浓度2.0μg/mL、封闭液1.0%OVA、抗血清稀释80000倍、竞争反应时间30 min、二抗稀释度为8000倍、发光底物125μL/孔。其线性回归曲线方程为y=49.82-20.14x,R~2=0.9966,半抑制浓度IC_(50)为0.973 ng/mL,最低检出限为0.010 ng/mL,线性范围0.032~30.244 ng/mL,在面粉和燕麦中的平均加标回收率为82.4%~96.1%和81.5%~93.4%,批内变异系数与批间变异系数均小于12%,与液质方法比较准确度无显著差异;与其他几种食品中的常见真菌毒素无交叉反应。可快速、准确、灵敏地测定谷物中TA检测。     

直接竞争酶联免疫吸附分析方法测定食品中的苏丹红Ⅰ号

苏丹红是一类人工合成的偶氮染料,对人体具有潜在的致癌作用,但是仍有不法商贩将苏丹红添加到食品中使食品色泽鲜亮持久,吸引消费者,牟取利润.测定苏丹红的方法主要是色谱分析法,但色谱法仪器昂贵、样品预处理复杂、费时,检测成本高.酶联免疫吸附分析方法(ELISA),是基于抗原与抗体之间高灵敏、高特异性反应的一类分析方法.     

酶联免疫吸附分析法测定水中双氯芬酸钠

本研究报道一种高灵敏度的测定自来水和表面水中药物残留双氯芬酸钠含量的间接酶联吸附分析法(ELISA)。在包被抗原为20μg/L,抗体为1∶20000倍稀释,辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG为1∶20000倍稀释的优化条件下,双氯芬酸钠的检出限(LOD)为0.004μg/L~0.008μg/L,IC50值(标准曲线中吸光度抑制至最大吸光度值的50%时所对应的待测物浓度)为0.03μg/L~0.12μg/L。双氯芬酸钠在自来水中和表面水中的回收率分别为96%和113%。表面水存在一定的基体效应,但仅需要简单过滤稀释就可以消除。     

酶联免疫吸附法直接测定血清雌二醇

本合成了３种不同载体蛋白的雌二醇抗原，研究了载体蛋白免疫原性对雌二醇抗体产生的影响。应用酶联免疫吸附分析法测定了血清中雌二醇，浓度范围为５－１６０ｎｇ／ｍｌ（１．８×１０＾－＾８－５．９×１０＾－＾７ｍｏｌ／Ｌ）．ＲＳＤ％小于１０．％，检测限为１．９７ｎｇ／ｍｌ，相当于９８．５ｐｇ／孔（按空白平均值的二倍标准偏差计算）。另外，本还建立了一种用考马斯亮蓝Ｇ－２５０测定半抗原与蛋白结合比的方法，提     

氯黄隆酶联免疫吸附分析技术研究

对邻氯苯磺酰胺进行衍生合成半抗原,并与载体蛋白质共价偶联制备突出氯黄隆分子特异性部分的合成抗原,以合成抗原免疫兔获得对氯黄隆具高亲合力的抗血清。采用硫酸铵盐析和ＤＥＡＥ纤维素反相吸附法分离纯化抗体,用辣根过氧化物酶以改良的过碘酶钠法标记 混合酸酐法标记半抗原。在此基础上建立了对氯黄隆具高度特异性的同接竞争,包被抗体,包被抗原直接竞争酶联免疫吸附分析技术。在优化条件下,氯黄隆测定的线性浓度范围为１０＾０－１０＾３ｎｇ／ｍＬ,检出限〈０．１ｎｇ／ｍＬ。邻氯苯磺酰胺及与氯黄隆结构类似的常用磺酰脲类除草剂不干扰氯黄隆的分析。