液相色谱Z值对溶菌酶分子构象变化的定量表征

目前, 研究蛋白分子的构象变化用得最多的是光谱法, 如荧光光谱、圆二色谱和核磁共振谱等[1]. 由于蛋白质分子构象变化与其在色谱中的保留行为直接相关[2], 所以色谱法也成为研究蛋白质分子构象变化的一种新方法[3]. 此外, 计量置换理论中的Z值也已被成功地用于表征生物大分子的构象变化[4]. 用Z值研究蛋白质分子构象变化的优点是可以使用不纯的样品, 这是因为在测定Z值的过程中会与其它组分相分离. 使用Z值还会对蛋白分子构象变化进行定量表征[5,6]. 本文以溶菌酶(Lys)为目标蛋白, 用色谱法[反相液相色谱(RPLC)和弱阳离子交换色谱(WCX)]系统地研究了Lys在不同变性(胍变非还原、脲变非还原、胍变还原和脲变还原)环境中因疏水性及电荷分布的不同对Lys分子构象变化的影响, 并用Z值进行了定量表征.     

高效弱阳离子交换色谱法对脲还原变性溶菌酶的折叠研究

用高效弱阳离子交换色谱(HPWCX)对脲还原变性溶菌酶(Lys)进行了复性研究. 在流动相中脲浓度固定为4.0 mol•L^－1和选用对天然态蛋白有稳定作用的硫酸铵为盐或置换剂时, 在蛋白浓度为15.0～50.0 mg•mL^－1时, HPWCX法比稀释法活性回收率高. 为了提高Lys的质量及活性回收率对所用色谱条件进行了优化研究, 当蛋白起始浓度为20.0 mg•mL^－1时, Lys的质量回收率和活性收率分别为97.8%和95.4%. 表明此种方法简便且有可能对其他还原变性蛋白的复性具有通用性.     

参数Z对疏水色谱中胍变蛋白质分子构象变化的表征

用计量置换参数Ｚ对疏水色谱流动相中存在盐酸胍时蛋白质分子构象变化进行了表征。除溶菌酶外，其余４种蛋白质的Ｚ值随盐酸胍浓度的增大先增大，而后减小。将盐酸胍和脲对蛋白质Ｚ值的影响进行了比较后发现，在疏水色谱中Ｚ值作为蛋白质分子构象变化表征的一个重要的结论是随变性剂浓度的增大，埋藏在蛋白质分子内部的疏水性氨基酸残基暴露到分子表面的程度逐渐增大，造成了Ｚ值随蛋白质分子构象变化程度的增大而减小。蛋白质的Ｚ值随盐酸胍及脲浓度变化的不同特点，反映了两者对蛋白质变性机理的不同。     

反相液相色谱中温度对蛋白分子构象变化的新表征

液相色谱中溶质计量置换保留模型的Ｚ值可用来对反相高效液相色谱中热变蛋白的分子构象进行表片。发现在异丙醇－甲酸４４％（Ｖ／Ｖ）－水体系为流动相对完全变性蛋白的Ｚ值随温度升高而降低。且Ｚ值与绝对温度例数（１／Ｔ）成正比，因此蛋白分子构象变化可用Ｚ对１／Ｔ作图所得两条直线的斜率差值来表征，差值愈大，蛋白分子构象变化愈甚。该两直线的交点即为蛋白分子构象的突变温度。与通常采用的１ｇＫ＇对１／Ｔ的作图相比，用     

用参数Z表征疏水色谱中脲浓度与蛋白质分子的构象变化

研究了５种标准蛋白在流动相中含有不同脲浓度条件下的疏水色谱保留行为。当脲浓度不变时，蛋白质的保留仍然服从计量置换保留模型，并可测定在该特定脲浓度条件下蛋白质的Ｚ值。计量置换参数Ｚ可作为疏水色谱中生物大分子的构象变化的表征。     

液相色谱中一个新的表征参数Z Ⅳ.反相液相色谱中甲酸浓度与生物大分子的构象变化

反相高效液相色谱中蛋白质分子的Z值可以作为平衡状态下蛋白分子构象变化的表征,它与蛋白分子起始状态构象无关。在异丙醇-甲酸-水体系中蛋白的Z值会因流动相中甲酸浓度的增大而减小。除蛋白分子构象变化因素外,蛋白Z值的变化也与甲酸参与蛋白与置换剂分子间的计量置换过程有关。在蛋白分子未完全失去分子立体结构时,其Z值与分子量的立方根成正比。当甲酸浓度足够大时,例如大于40％(V/V)时,蛋白分子完全失去三维结构。     

参数Z对疏水色谱中胍变蛋白质分子构象亦化的表征

用计量置换参数Ｚ对疏水色谱流动相中存在盐酸胍时蛋白质分子构象变化进行了表征。除溶菌酶外，其余４种蛋白质的Ｚ值随盐酸胍浓度的增大先增大，而后减小。蛋白质的Ｚ值随盐酸及脲浓度的增大，埋藏在蛋白质分子内     

液相色谱中一个新的表征参数Z：Ⅳ.反相液相色谱中甲酸浓度与生物大…

反相高效液相色谱中蛋白质分子的Ｚ值可以为平衡状态下蛋白分子构象变化的表征，它与蛋白分子起始状态构象无关，在异丙醇－甲醇－水体系中蛋白的Ｘ值会因流动相中甲酸浓度的增大而增小，除蛋白分子构象变化因素外，蛋白Ｚ值的变化也与甲酸参与蛋白与置换剂分子间的讲师置换过程有关，在蛋白分子未完全失去分子立体结构时，其Ｚ值与分子的立方根成正比，当甲酸浓度足够大量，例如大于４０％（Ｖ／Ｖ）时，蛋白分子完全失去三维结构。     

液相色谱中的一个新的表征参数Z Ⅲ.反相高效液相色谱中的生物大分子分离体系

研究了在反相高效液相色谱中的烷基醇-甲酸-水、烷基醇-三氟醋酸-水和烷基醇-磷酸盐-水三种流动相,9种生物大分子的分离体系中Z的表征。发现当蛋白质完全变性时,Z值与其分子量呈正比,而与置换剂分子大小呈反比。Z值会因流动相中离子对试剂的存在而减小,且浓度愈大,减小程度愈甚。对于在异丙醇-水溶液中的不同种类离子对试剂而言,对蛋白构象变性影响的减小顺序为44％(V/V)甲酸>0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH<2.5)>0.1％(V/V)三氟醋酸。     

非还原脲变性蛋白溶菌酶稀释复性过程中集聚现象的研究

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、阴极聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效凝胶排阻色谱法, 研究了非还原脲变性蛋白溶菌酶在稀释复性过程中的集聚现象. 实验发现, 在整个稀释复性过程中, 没有蛋白溶菌酶集聚体沉淀产生. 当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度小于4.0 mg/mL时, 复性过程中不会形成蛋白溶菌酶分子集聚体; 当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度介于4.0～8.0 mg/mL时, 复性过程中会形成由非共价相互作用所引起的蛋白溶菌酶二分子和三分子集聚体; 而当最终复性液中蛋白溶菌酶浓度大于8.0 mg/mL时, 复性过程中除了会形成二分子和三分子蛋白溶菌酶集聚体外, 还会形成四分子蛋白溶菌酶集聚体. 在此基础上, 结合文献, 对非还原脲变性蛋白溶菌酶的稀释复性过程进行了描述.     

Refolding of Denatured／Reduced Lysozyme Using Weak－Cation Exchange Chromatography

Oxidative refolding of the denatured/reduced lysozyme was investigated by using weak-cation exchange chromatography (WCX). The stationary phase of WCX binds to the reduced lysozyme and prevented it from forming intermolecular aggregates. At the same time urea and ammonium sulfate were added to the mobile phase to increase the elution strength for lysozyme. Ammonium sulfate can more stabilize the native protein than a common eluting agent,sodium chloride. Refolding of lysozyme by using this WCX is successfully. It was simply carried out to obtain a completely and correctly refolding of the denatured lysozyme at high concentration of 20.0 mg/mL.     

端羟基硅胶与环状酸酐反应制备分离蛋白质的高效弱阳离子交换色谱填料

硅胶与含环氧基有机硅烷反应、产物与二元醇加成后再与环状酸酐反应,制得分离蛋白质的弱阳离子交换色谱填料。     

高效阳离子交换法分离纯化蛋清中的溶菌酶

 建立了用高效阳离子交换分离纯化蛋清中溶菌酶的新方法 ,讨论了纯化的工艺条件。蛋清样品匀浆后 ,用氯化钠初步纯化 ,然后用弱阳离子交换柱XIDACE WCX分离。结果表明 ,被纯化的溶菌酶和杂蛋白得到很好分离。经活性检测 ,溶菌酶过柱后的活性回收率为 10 7% ,蛋白的比活为 15 4 6 7U/mg ,纯化倍数提高了 5 6倍。用尺寸排阻 (SEC)鉴定 ,得到的溶菌酶呈均一性。该法较传统软基质低压离子交换分离速度快 ,纯化效率高。     

分离蛋白质的高效强阳离子交换色谱填料的合成及性能研究

带端羟基的大孔硅胶与氯磺酸反应制得分离蛋白质的强阳离子交换色谱填料。填料分离度高,蛋白质活性回收率大于７６％,可用于蛋白质及生物工程产品的分离。     

蛋白质在离子交换色谱上选择性和非吸附特性

对蛋白质在离子交换柱上选择民性和非吸附特性进行了研究。蛋白质在有机磷酸锆阳离子色谱柱上,其保留作用随流动相ｐＨ值在离子强度的增加而减小;蛋白质在强阳离子和强阴离子色谱柱上的保留作用,即是流动相中的ｐＨ值等于蛋白质的等当点,其净电荷为零。不册蛋白质仍有不同程度的保留,这主要是由于蛋白质的三维结构使电荷 密度的大小和分布的不均匀以及离子交换填料表面性质的影响。