基于CRISPR/Cas的生物传感平台在分子诊断中的应用

簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)不仅在基因工程领域炙手可热,而且正发展成为核酸精准检测领域的新利器.得益于Cas蛋白对核酸序列的特异性识别以及部分Cas蛋白的附属切割活性,Ⅱ类CRISPR/Cas系统在体外诊断及现场即时检测领域独具优势.该综述简要介绍了CRISPR/Cas系统...     

环介导扩增与石英晶体微天平快速检测核酸

建立环介导恒温扩增(LAMP)-石英晶体微天平(QCM)原位快速检测核酸的方法。将环介导恒温核酸扩增(LAMP)技术与石英晶体微天平(QCM)技术相结合,采用巯基化试剂分子组装方法,将LAMP反应体系中的4个引物之一固定于QCM电极上,在安装所述电极的QCM检测池中配置LAMP反应体系并进行环介导恒温核酸扩增,用QCM仪器在线原位检测频率变化,判断LAMP反应是否发生,进而判断体系中是否存在目标核酸特异基因。该方法检测核酸特异性强、灵敏度高,并且操作简便,有望发展成为快速筛查检测核酸的有效手段。     

CRISPR/Cas技术在核酸检测中的应用进展

CRISPR/Cas是大多数细菌及古细菌基于RNA的后天免疫系统。由CRISPR/Cas系统改造而成的CRISPR/Cas技术已成为一种强大的基因编辑工具,广泛应用于基因功能研究和基因修饰与治疗。除了作为基因编辑工具,Ⅱ类Cas蛋白具有的"附属切割"特性,已被开发成一种快速、低成本且高灵敏的核酸检测工具,在核酸分子诊断领域具有重要的应用潜力。该文总结了3种Ⅱ类Cas蛋白在核酸检测领域的代表性研究进展,并对CRISPR/Cas系统在该领域的应用前景进行了展望。     

基于CRISPR/Cas的生物传感器在食源性病原菌检测中的应用进展

食源性病原菌严重威胁食品安全及消费者的健康,因此,对食源性病原菌快速、准确的检测方法对保障食品安全尤为重要。规则成簇的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR相关系统（CRISPR-associated systems, Cas）生物传感器是在引导核糖核酸（RNA）的作用下,使Cas蛋白与RNA形成RNA复合体,并对靶标基因进行特异性识别,从而将靶标信号转化为可检测的物理和化学信号。CRISPR/Cas生物传感器具有特异性好、可编程以及使用简便等优势,在病原菌检测领域具有广阔的应用前景。本文根据Cas蛋白的种类和作用机制不同,分别介绍了不同CRISPR/Cas系统的作用原理和特点,概述了基于不同CRISPR/Cas的生物传感的信号识别、信号放大、信号输出策略及其在食源性病原菌检测中的应用进展,讨论了基于CRISPR/Cas的多重生物传感器的构建原理及其在多病原菌同时检测中的应用,分析了基于CRISPR/Cas的生物传感器在病原菌快速检测中面临的挑战及未来的发展趋势。     

基于分子信标策略的CRISPR/Cas12a荧光传感器用于循环肿瘤DNA的放大检测

构建了一种以分子信标（Molecular beacon, MB）为信号探针的CRISPR/Cas12a生物传感器,用于循环肿瘤DNA(Circular tumor DNA, ctDNA)的快速放大检测。MB具有良好的稳定性,其颈部末端分别标记有荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）两种荧光基团。ctDNA不存在时,CRISPR/Cas12a体系无活性,无法切割MB,因此MB两端的荧光基团由于形成发夹结构的颈部相互靠近而发生荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET）,显示出TAMRA的荧光。当ctDNA存在时,ctDNA特异性识别Cas12a/crRNA二元复合物并激活Cas12a的反式切割活性。由于单链DNA是Cas12a最敏感的底物,因此MB的环部单链首先被切割,继而引起颈部双链的解离而导致两种荧光团彼此远离,无法发生FRET,最终显示出FAM的荧光信号。对MB环部的碱基数目、MB浓度以及crRNA与Cas12a的浓度比例等实验条件进行了优化。在最优条件下,1.7～500 pmol/L范围内,ctDNA浓度与传感...     

基于核酸分子光开关的闭管可视化环介导等温扩增检测方法

该研究采用核酸分子“光开关”[Ru(bpy)₂(dppz)]²⁺作为环介导等温扩增(LAMP)荧光染料,建立了一种快速、直观的闭管可视化LAMP检测方法。为避免高浓度染料对LAMP反应造成的强烈抑制和开盖导致的气溶胶交叉污染,该文采用蜡封反应管进行检测,通过直接观察扩增产物DNA与[Ru(bpy)₂(dppz)]²⁺结合后产生的强烈红色荧光信号判定结果。该方法对金黄色葡萄球菌DNA的检出限可低至20拷贝/反应。方法特异性强,整个可视化检测过程可在1 h内完成,有望广泛应用于环境检测、食品安全、临床诊断等领域的现场快速核酸检测。     

病原微生物的核酸检测分析研究进展

2019年12月,全球爆发新型冠状病毒肺炎疫情(COVID-19),使生物安全面临着巨大危机.病原微生物的快速、准确、低成本检测是保障生物安全的重要组成元素之一,是疫情预防、控制和诊断的关键.本综述介绍了核酸测序技术、等温扩增技术和基因编辑技术(CRISPR/Cas)于便携式一体化设备中的应用,为研发"低成本,高效率,...     

胃腺癌核酸适配体的筛选与特异性研究

核酸适配体可作为分子探针应用于胃腺癌的早期诊断和治疗,具有广泛应用前景。本实验利用Serum-SELEX（Ser-SELEX）技术筛选胃腺癌核酸适配体。通过对候选适配体二级结构分析,其二级结构多为茎环结构。圆二色谱分析显示,7条候选核酸适配体呈右手螺旋特征。通过荧光定量核酸扩增检测系统（q-PCR）检测了候选核酸适配体对胃腺癌靶标的亲和力,表明候选核酸适配体浓度梯度与Ct值均呈正相关,亲和力常数为纳摩尔级别。利用q-PCR法、量子点法验证了候选核酸适配体识别靶标的特异性,结果均显示Apt-101对靶标亲和力更高,特异性更强,Apt-101的平衡解离常数（K_d值）为6.444±1.128nmol/L,特异性检测阳性率大于70%。     

发卡型万能传导在基于核酸分子线路的基因诊断中的应用和性能优化

核酸等温扩增技术作为核酸体外扩增技术,其反应过程始终维持在恒定温度下。与聚合酶链反应相比,核酸等温扩增反应具有优异的便携型,因而被视为最有望实现基因快检甚至即时快检的体外基因扩增方法。然而,由于反应过程中假阳性扩增频发、反应后对产物的检测方法缺乏特异性和灵敏度等缺点,限制了其在实际分析检测中的应用。通过构建发卡型结构万能中转探针,成功地将恒温扩增产物转到一套性能良好的已知核酸分子线路上;借助核酸分子线路的百倍放大性能和序列特异性,实现对上游基因序列信息的精准识别和放大信号输出。针对不同的待测序列,仅需改变发卡型中转探针的序列,即可实现对不同序列目标物的检测。基于中转探针的重要性,本研究对中转探针的设计原理和方法进行了重点阐述,提出并验证了一套行之有效的普适性设计规律,确保中转探针良好的中转效率(信噪比)。利用这一规律获得的中转探针,与核酸分子线路偶联,可成功为低至近单分子(20个拷贝)的模型基因提供显著荧光和电化学信号输出。     

芯片毛细管电泳用于人乳头瘤病毒分析的研究进展

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）是一种常见的球形DNA病毒,目前已报道其可以导致6种类型的癌症发生,因此HPV病毒检测方法的研究引起了人们的重视。芯片毛细管电泳（MCE）,作为一种芯片实验设备,结合各种信号放大技术为HPV分型检测提供了简单、快速、高灵敏度和易便携化的检测方法。该文综述了MCE在常规HPV分型检测中的最新研究进展,主要分为MCE技术和MCE结合核酸扩增技术两个部分。综述的第一部分介绍了MCE系统、MCE芯片结构设计和电泳分离方法。典型的MCE系统包含了高压电源、分离芯片、电解液池、进样系统、检测系统等。该文还介绍了近年来应用最广泛的4种芯片通道,包括分离直通道、T型通道、蛇形通道以及双通道,并分别对它们的优缺点进行了比较。第二部分主要介绍芯片电泳在HPV检测中的应用和发展。由于MCE技术的应用,HPV目标物的分离时间,从以前的几个小时缩短到几分钟,极大地提高了分离速度。重点介绍了各种核酸扩增技术结合MCE检测HPV的方法。对聚合酶链式反应（PCR）和MCE结合用于HPV的检测技术、环介导等温扩增（LAMP）技术的HPV检测方法、基于PCR结合限制性片段长度多态性（RFLP）技术用于HPV分型的DNA检测、基于核酸序列扩增（NASBA）技术检测HPV mRNA、巢式PCR等进行了比较分析。其次,对HPV其他检测方法进行了总结,其中包括PCR结合傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）、纳米技术、DNA探针结合电化学方法、亚铜粒子氧化还原锌掺杂的二硫化钼量子点结合T7外切酶电化学发光法和基于CRISPR/Cas12a的环介导等温扩增法。在这些非MCE方法中,电化学传感法,如阻抗法、脉冲伏安法和流动生物传感器,由于背景信号低、时间控制能力强,是一种比较理想的方法。最后,虽然近年来MCE技术得到了发展,所开发的设备得到了应用,但目前在MCE技术、方法和应用方面仍然存在一些挑战。MCE技术在HPV分型检测应用中面临的第一个挑战是,MCE本身无法对HPV核酸进行信号放大,从而不能在HPV的高灵敏和高选择性分析中得到很好的应用。第二个挑战是,虽然有一些研究者已经成功地将PCR和MCE集成在一个芯片上,但该技术的广泛应用仍面临困难,目前仍然没有真正集成的PCR-MCE芯片用于HPV检测。第三个挑战是目前MCE技术无法实现小型化、自动化器件的制造。最后,文章就MCE在HPV分型检测中开发更自动化、更快速以及更稳定可靠的检测技术提出了一些观点和见解,希望能对感兴趣的读者提供一些启发。     

集成式微流控液滴数字化等温扩增用于尿路感染细菌快速检测

数字化核酸分析技术具有不依赖标准品的绝对定量分析能力,因而有利于实现病原分子的快速诊断。现有的数字化核酸分析方法通常采用离线式分析,操作繁琐且耗时较长,难以满足医疗资源有限情况下的检测需求。本研究建立了一种集成式微流控液滴数字化等温扩增方法。采用的微流控芯片集成了序列液滴核酸提取、负压驱动液滴生成和液滴环介导等温扩增(LAMP)功能,可采用集成化方式在1.5 h内完成细菌核酸数字化分析。此微流控芯片对大肠埃希氏菌的核酸提取效率为93.68%±32.38%;使用注射器负压驱动可在4 min内生成约20000个液滴,液滴体积的相对标准偏差(RSD)小于10%;液滴数字化LAMP检测动态范围跨越4个数量级(2.36×10⁴～1.71×10⁷ CFU/mL)。利用本方法检测尿路感染临床标本(n=13)中的大肠埃希菌,与传统定量培养方法结果相比较,本方法的检测灵敏度和特异性均为100%(K_appa=1,p<0.01)。本方法具有操作简便、定量分析准确的优点,为病原体的现场快速检测提供了一种有力的工具。     

达安基因两产品获欧洲CE认证

达安基因公司近期通过了BSI（英国标准协会）的认证，荣获BSI颁发的医疗器械质量管理体系（ISO13485）认证证书、沙眼衣原体核酸扩增荧光检测试剂盒（CT）CE证书及人巨细胞病毒核酸扩增荧光检测试剂盒（CMV）CE证书。     

非病毒基因编辑CRISPR/Cas9递送载体的研究进展

基因编辑技术是指能对目标基因片段进行编辑,包括敲除、敲入等。近年来,基因编辑技术得到了很大的发展,包括规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)在内的一系列基因编辑技术受到了广泛的关注。CRISPR/Cas9主要利用限制性内切酶,在蛋白或RNA的引导下,使目标位置的DNA双链断裂,在治疗基因表达异常引起的疾病方面表现出了巨大的潜力。应用这项技术进行基因编辑的关键点之一是,必须要将相关的蛋白或核酸高效地递送到细胞核中。相对于病毒载体,非病毒载体在安全性及规模化生产方面表现出了更高的优越性,是目前基因编辑递送载体发展的重点。本文对近期基因编辑CRISPR/Cas9非病毒递送载体的重要进展进行综述,介绍了非病毒载体的优势,在非病毒载体体系中,着重介绍脂质体和高分子载体在CRISPR/Cas9技术应用中的近期进展,并展望了非病毒CRISPR/Cas9递送载体在未来的发展方向。     

核酸适配体介导的荧光铜纳米簇用于免标记快速检测水胺硫磷

基于核酸适配体的靶标识别能力和铜纳米簇（CuNCs）优良的荧光性能,本研究开发了一种免标记荧光探针用于有机磷农药水胺硫磷（ISO）的快速检测。当靶标分子ISO不存在时,溶液中ISO的核酸适配体和互补DNA形成双链结构,从而介导合成荧光CuNCs,表现出高的荧光信号;当待测样品中存在ISO时,ISO与其核酸适配体形成复合物,释放出单链互补DNA。游离的单链DNA不能介导合成CuNCs,导致溶液中的荧光信号减弱。在最佳条件下,检测体系的荧光抑制率与ISO浓度的对数在0.05～25 mg/L浓度范围内呈线性关系,检出限为47μg/L (3σ),其它物质对其检测几乎没有干扰。将此探针用于检测水样中的ISO,回收率为80.3%～108.0%。研究结果表明,本方法可用于检测实际样品中的ISO残留。     

基于微流控芯片的72重单核苷酸多态性族群推断系统的构建

建立了常染色体单核苷酸多态性（SNPs）复合检测芯片体系,用于未知个体的族群来源推断。基于前期筛选的74-SNPs组合,采用竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应（PCR）的原理构建SNPs的扩增体系,在微流控芯片的每个反应孔内完成一个SNP的检测,通过高通量PCR微流控芯片实现了其中72个SNPs的同步检测。芯片的扩增由平板PCR仪完成,反应孔的荧光信号通过激光共聚焦扫描仪检测,最终通过提取的荧光值进行结果分析。使用该芯片检测获得52份样本的SNPs分型,分型结果的准确率为100%。以57个人群的3628个样本为参考人群数据库,进行20份样本的族群来源推断,推断结果与样本的实际来源一致。本研究建立的常染色体72个SNPs微流控芯片体系可以有效地进行SNP多态性分析检测,基于参考数据库,20份检测样本族群推断的准确性为100%。     

基于荧光共振能量转移的核酸适配体传感器检测环丙沙星

建立了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的核酸适配体传感器,并用于检测实际水体和牛奶中的环丙沙星（CIP）。为了防止羧基荧光素（FAM）被CIP猝灭,FAM和四甲基罗丹明（TAMRA）分别标记在互补单链DNA(FAM-cDNA)和适配体（TAMRA-APT）,通过DNA杂交发生FRET, TAMRA有效猝灭FAM的荧光。CIP加入后,其与FAM-cDNA发生亲和力竞争反应,CIP与TAMRA-APT形成结构更稳定的CIP/TAMRA-APT复合物,使体系FAM的荧光恢复。在优化条件下,本方法对CIP表现出高灵敏度和高选择性,检测浓度线性范围为0.01～1μmol/L,检出限为6 nmol/L;对实际水样和牛奶的加标回收率为90.4%～113.2%,相对标准偏差为1.8%～11%。该荧光适配体传感器具有成本低、灵敏度高、特异性好等优点,在环境中CIP残留快速检测方面具有良好的应用潜力。     

一种用于核酸绝对定量检测的高鲁棒性液滴式数字PCR芯片

为满足液滴式数字聚合酶链式反应（PCR）技术对扩增反应过程中稳定保存液滴以及反应后高效检测的核心需求,构建了一种具有过滤气泡和增强荧光信号功能的液滴式数字聚合酶链式反应芯片.该芯片可在10 min内产生20多万个半径约为21 μm的液滴.利用“玻璃天花板”的方式构建了独立于芯片主体材料的液滴收集腔,为液滴提供稳定的保存与反应环境;还构建了过滤结构,可有效过滤混入液相中的空气,提高芯片鲁棒性.同时,在液滴收集腔中引入反射层,增强荧光信号,使单个视野荧光成像时间缩短约40%,提高了检测效率.利用该芯片定量检测EGFR基因第21号外显子,检测信号与DNA浓度在10¹~10⁵ copies/μL范围内呈现良好的线性关系（R²=0.998）.该方案在载玻片大小的芯片上实现了液滴产生、PCR扩增和荧光信号读取,并具有较高的鲁棒性与检测效率,在核酸检测等方面具有应用潜力.     

CRISPR/Cas9基因编辑非病毒递送系统

规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和g RNA的细胞及活体递送等问题.近年来,研究人员通过开发多种非病毒递送载体,实现了编码CRISPR/Cas9基因编辑工具的DNA和信使RNA(mRNA)以及Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的递送,并应用于靶基因的化学修饰与编辑调控.本文主要概述了近期CRISPR/Cas9基因编辑递送的研究进展,并对其化学生物学应用前景进行了展望.     

基于NaYF4:Yb,Er上转换荧光纳米颗粒精准检测DNA

建立了一种利用碱基堆积原理并以上转换纳米粒子荧光作为内参的精准检测DNA的方法。该方法首先利用热分解法制备NaYF₄：Yb,Er上转换荧光纳米颗粒（upconversion nanoparticles,UCNPs）,再通过表面羧基化变性牛血清蛋白修饰后与氨基化探针核酸单链共价偶联,形成上转换荧光标记显示探针。最后再基于碱基堆积原理进行杂交检测。研究结果表明以NaYF₄：Yb,Er荧光强度为内参,根据FAM/UCNP的强度比来定量检测目标DNA浓度比单一的以报告DNA中FAM荧光强度定量检测目标DNA浓度要更为精准,有效地避免了实验中出现的人为操作和仪器误差。本方法不需要进行扩增,检测底限可达到5 nmol·L^-1,且在较大的浓度范围内有较好的线性关系,同时该方法也有着良好的特异性,能有效区分单碱基错配序列。     

基于毛细管电泳的环介导恒温扩增技术检测方法研究

以大肠杆菌(E.coli)为对象,采用环介导恒温扩增技术(LAMP)对其扩增,在实验室自制的毛细管电泳-诱导荧光平台上建立了LAMP产物的检测新方法。引物F3,B3,FIP,BIP扩增的E.coli LAMP产物大小为240 bp。优化的毛细管电泳条件为:毛细管有效长度/总长度(10 cm/15 cm),筛分介质溶液为0.5%羟乙基纤维素(1 300 K),电场强度(100 V/cm),进样条件(100 V/cm,1.0 s)。毛细管电泳时,DNA长度在100~500 bp范围内与其迁移时间呈线性关系,相关系数为0.996。在相同毛细管电泳条件下对E.coli LAMP产物进行分析,并利用这种线性关系在电泳图中对E.coli LAMP产物与假阳性产物做区分,结果表明,毛细管电泳技术不仅可在15 min内实现LAMP产物及附加产物的快速检测,而且可快速区分LAMP阳性及假阳性实验产物。采用建立的毛细管电泳快速检测LAMP产物的方法,对AB0174 E.coli基因实施了LAMP,结果表明该方法适合DNA LAMP产物的快速检测。