新型基因编辑技术CRISPR/Cas9系统研究现状

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated,CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌防御外来噬菌体、质粒或其他外源DNA侵染的获得性免疫系统.依据Cas蛋白种类和同源性,CRISPR/Cas系统被分为3类,其中,Ⅰ类和Ⅲ类需要多种Cas蛋白参与,而Ⅱ类系统,即CRISPR/Cas9组成简单,仅需Cas9蛋白参与即可.经过遗传工程改造后的CRISPR/Cas9已经作为一种新型的基因编辑工具被用于多种生物的基因组编辑.本文就CRISPR/Cas9系统的发现、结构组成、作用机制、研究现状、面临的困境及应用前景等几方面进行了总结.     

基因组编辑技术——CRISPR/Cas系统

基因定点编辑技术包括基于胚胎干细胞及同源基因片段重组的基因打靶技术、锌指结构(ZFN)、类转录激活因子效应物(TALEN)以及CRISPR/Cas系统,CRISPR/Cas系统具有操作简单、突变率高、成本低,同时可针对多个基因等优点;该技术可进行定点修饰,如敲除、插入、替换等.目前CRISPR/Cas系统已成功应用到小鼠、人类细胞、线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和猴等.文章将对基因修饰技术发展脉络做统一梳理,并将系统阐述CRISPR/Cas系统的原理、应用以及该技术的优缺点.     

CRISPR/Cas9基因组编辑新进展

正2016年4月份,美国农业部(USDA)在一封公开函中声明,他们不会对利用CRISPR/Cas9技术得到的基因编辑蘑菇进行监管。这意味着这种蘑菇可以不通过相关机构的监管程序就可以栽培并销售。这是第一种得到美国政府绿灯通行的利用CRISPR/Cas9技术得到的有机体,也是过去5年中不受USDA监管的30种基因改造有机体之一。这30种有机体大多数是植物,其中几种是通过ZFN和TALEN基因编辑技术得到的,而使用CRISPR/Cas9技术得到的作物终于也得到了同样的通行政策。该项目的参与者、中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员高彩霞说:我有信心看到将有更多的基因编辑作物不受管理部门的监管。     

水稻OsDTH10基因CRISPR/Cas9编辑突变体的创建及功能分析

为了探究OsDTH10基因在水稻生长发育及开花中的作用,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsDTH10基因进行定向编辑.在OsDTH10基因的第4个外显子处设计sgRNA的靶位点,通过PCR扩增与Os U6SK空载体连接形成OsU6SK-sg RNA融合载体,再将获得的sg RNA和Cas9连接到植物双元载体pCAMBI1300中,得到重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10.利用农杆菌介导的植物转化法得到转基因植株,对其进行鉴定并测序.本研究共获得3个株系8株转基因植株,测序结果显示,2号株系的4株转基因植株由于发生了单碱基的插入,基因测序出现了套峰.田间表型观察发现,2号株系的4株T0代转基因植株抽穗期早于空载体对照,获得的T1代转基因植株抽穗期比对照的提早8 d.这些结果表明,重组载体pCAMBI1300-CRISPR/Cas9-OsDTH10成功实现了对水稻OsDTH10基因的定向编辑.     

CRISPR/Cas系统在谱系追踪中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌的自适应免疫系统,其对基因组高效精准的编辑,极大地推动了发育生物学、表观遗传学、药物开发、疾病治疗等多个学科和研究领域的发展.CRISPR/Cas9系统诱导基因组DNA产生双链断裂,以非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)的方式进行修复,因此会在剪切位置随机地引入短的插入和删除(insertions and deletions,indels).这些引入的indels作为区分细胞的标签,被称为条形码.细胞条形码技术已经被用于谱系追踪、基因组功能筛选等.而测序技术的飞速发展和成本的大幅度降低以及单细胞转录组测序技术的出现,可以在时间和空间层面同时对数百万个单细胞进行谱系追踪,记录细胞活动.本综述讨论了CRISPR/Cas系统的工作原理、细胞条形码技术和单细胞测序技术(scRNA-seq),以及两者结合产生的单细胞谱系追踪技术.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻植酸合成酶IPK1基因

低植酸是作物育种目标之一,然而植酸对植物自身的影响至今未有科学评估.为此,在建立粳型常规水稻"金粳818"再生体系基础上,利用农杆菌介导的遗传转化方法将针对植酸合成最后一步磷酸化反应的1, 3,4, 5, 6-五磷酸肌醇2-激酶基因IPK1构建的3个CRISPR/Cas9载体分别转入"金粳818".分子检测发现,再生的42株植株中,40株为转化株,显示转化率高达95%.靶点序列分析发现,26株绿色转化株中,1株基因组发生了编辑.编辑株靶点测序发现,除碱基缺失外,附近序列错配达30%.这些结果为水稻低植酸种质的创制及植酸的功能分析奠定了技术基础.同时,本文对水稻再生株的白化现象进行了探讨.     

RNA靶向基因组编辑技术CRISPR/Cas9在昆虫中的研究进展

介绍CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制、脱靶效应以及在昆虫基因编辑和基因功能研究中的应用,并对该技术可能出现的问题及应用前景进行展望,为进一步将该技术应用于非模式昆虫的基因编辑和基因功能研究提供参考.     

CRISPR/Cas9基因转录激活技术的建立及其应用

建立基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,实现在HEK293细胞中激活cGAS基因的转录。首先利用慢病毒载体构建稳定表达Cas9的HEK293细胞;并采用Real-time PCR和western blot方法鉴定Cas9蛋白质表达效果。再选取不同靶序列,分别构建用于激活cGAS基因转录的sgRNA载体,将构建好的序列载体与CRISPR体系工具质粒共转染至稳定表达Cas9的HEK293细胞中。采用Real-time PCR方法检测细胞中内源cGAS的转录激活效果。成功建立了基于CRISPR/Cas9的基因转录激活技术,并在c GAS基因阴性表达的细胞中激活基因的转录。     

基于CRISPR/Cas9系统制备猪Pax2基因敲除细胞系

肾脏发育缺陷或缺失的猪模型可为人源化肾脏器官在异种动物体内再生提供“发育空位”,因此敲除肾脏发育关键基因Pax2(Paired box2)获得该动物模型是肾脏再生的关键步骤。本文利用生物信息学分析软件比对分析了不同物种间Pax2蛋白结构,明确了猪Pax2蛋白在氨基酸序列、二级结构和三级结构方面与人、小鼠具有相似性。结合Pax2蛋白在人和小鼠肾脏发育中的功能,选择猪Pax2基因第8外显子序列作为打靶目标区间,设计并构建了用于敲除猪Pax2基因的CRISPR/Cas9打靶载体。在检测CRISPR/Cas9载体打靶猪Pax2基因效率的基础上,利用细胞核转染和G418药物筛选获得巴马小型猪细胞单克隆。通过PCR、T载体克隆和Sanger测序检测各细胞单克隆Pax2基因的敲除情况,鉴定出33个双等位基因敲除Pax2基因的巴马小型猪细胞系,敲除效率达到45.21%(33/73)。本研究为肾脏缺失或肾发育不全的猪模型的获得奠定实验基础,同时为后续在猪体内再造人源化肾脏以及肾发育疾病的研究提供了研究材料。     

利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除人源HOIP基因

泛素化修饰是一种能调节诸多细胞功能的重要蛋白质翻译后修饰,近几年研究发现了一种新的泛素化修饰即线性泛素化修饰,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。目前LUBAC复合物的底物和功能所知甚少。为了探索LUBAC复合物新的底物和功能,利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建稳定敲除LUBAC核心组分HOIP基因的HeLa细胞系,通过质谱鉴定此细胞系和对照细胞的差异泛素化修饰蛋白质,即可能是LUBAC新的底物。首先将靶向HOIP基因的不同CRISPR序列插入lenti CRISPRv2载体中,制备慢病毒质粒感染He La细胞,然后使用嘌呤霉素压力筛选,用Western Blot方法检测HOIP基因的敲除效果,最后成功地构建HOIP基因稳定敲除HeLa细胞系。此稳定细胞系的构建为日后深入研究LUBAC的功能提供一个人类细胞模型。     

CRISPR/Cas9系统介导的斑马鱼park2基因的定点敲除

作为目前最新、最先进的基因编辑技术,CRISPR/Cas9系统为分子细胞生物学带来革命性发展,以它的简单高效、灵活性以及可实现DNA序列的定向突变而被广泛使用.斑马鱼的park2基因位于第13号染色体上,编码的Parkin蛋白是一个E3泛素连接酶.该基因在斑马鱼中的功能还不清楚.利用CRISPR/Cas9系统,首次在斑马鱼胚胎中实现了park2基因的大片段删除.由于斑马鱼在发育和疾病研究中有很大优势,实现park2基因敲除将有助于将来进一步研究该基因的功能.     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了...     

CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用

木本植物育种周期长、种质资源匮乏,已成为限制木本植物种质创新的主要因素。CRISPR/Cas系统是近年来发展起来的能够实现对基因组进行精准定点编辑的技术,具有操作简单、周期短、效率高等优点,可实现基因的敲除、插入、替换等目的,从而精确地引入目标性状。目前,该技术已在多种家畜、昆虫、作物中得到了成功应用,对大量性状进行了改良,实现了种质资源的原始创新,大大缩短了育种年限。CRISPR/Cas技术的产生为木本植物的遗传改良提供了契机。笔者对CRISPR/Cas技术在杨树(Populus spp.)、苹果(Malus spp.)、柑橘(Citrus spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、木薯(Cassava spp.)等木本植物育种中的应用进行了总结,该技术实现了T0代木本植物优良基因型的固定,在生长、材性、抗病性、抗旱性等性状上得到了明显改善,加快了木本植物育种进程,提高了育种效率。但该技术在木本植物中的应用尚处于起步阶段,还存在脱靶率高、编辑效率低、纯合突变少等问题。基于此,对CRISPR/Cas技术在木本植物中的应用前景进行了展望,以期为木本植物基因功能研究及品种改良提供有益参考。     

利用CRISPR/Cas9技术制备Mindin基因敲除小鼠

针对Mindin基因编码序列设计3条单链向导RNA(sgRNA),制备相应质粒,将表达sgRNA和Cas9蛋白的质粒共同电转入小鼠成纤维细胞L929中,通过药物筛选获得细胞库.经单克隆测序检测细胞库中基因组的突变效率,选择效率最佳的sgRNA.体外转录获取sgRNA和Cas9mRNA,进行小鼠受精卵的显微注射后提取小鼠基因组DNA测序鉴定.产生的40只小鼠中17只发生不同程度的碱基插入或缺失,其中23号小鼠缺失10个碱基造成移码突变,Mindin基因表达被破坏,成功构建出Mindin基因敲除小鼠,为深入研究Mindin基因的生物学功能奠定了基础.     

gRNA二级结构对拟南芥HD2基因CRISPR/Cas9编辑率的影响

近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计gRNA以及如何避免脱靶效应等。为了探究gRNA的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同gRNA接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示：不同gRNA接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计gRNA的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。     

利用CRISPR/Cas9系统可拯救失明小鼠

<正>英国《自然·通讯》杂志发表一项遗传学重要研究成果,一种基因组编辑方法能够阻止小鼠视网膜退化,进而拯救失明小鼠。其所述方法利用了CRISPR/Cas9基因治疗系统,可适用于导致色素性视网膜炎(失明的主要原因)的各种潜在遗传缺陷。色素性视网膜炎无法医治、不易觉察,对患者眼睛造成极大危害而且具有遗传性。该病特征就是视网膜退化,但由于色素性视网膜炎可能由60多种基因的突变引起,因此,想要制定针对性疗法     

基于CRISPR/Cas9系统构建Slfn2基因敲除的小鼠肺癌细胞系

为构建Slfn2^-/-小鼠肺癌细胞系(Lewis lung carcinoma, LLC),本文利用CRISPR/Cas9技术,在CHOPCHOP网站筛选Slfn2基因的sgRNA序列,将合成的oligo序列退火后连接至pLenti CRISPR v2质粒中,并与pMD2.G、psPAX2共转染至293T细胞中包装慢病毒;利用包装的慢病毒感染LLC细胞,经筛选和单克隆培养,获取Slfn2^-/-敲除的LLC细胞。结果显示：SgRNA成功插入载体重组质粒;利用3质粒包装的慢病毒成功将LLC中的Slfn2基因突变,获得丢失8个碱基移码突变和丢失180个碱基缺失突变的Slfn2^-/-小鼠肺癌细胞。可见,利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Slfn2基因敲除的小鼠肺癌细胞。     

靶向小鼠CREPT基因CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接,构建CREPT基因敲除质粒;体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体;体外切割实验结果显示,以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。     

利用CRISPR/Cas9系统建立成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型

目的 利用腺相关病毒9(AAV9)介导的CRISPR/Cas9系统构建成体心肌细胞特异性Oga基因敲除小鼠模型,来研究内源性OGA在成体心脏稳态维持中的功能。方法 首先,筛选靶向Oga编码区的有效sgRNA,构建包装表达有效sgRNA的AAV9病毒。其次,建立心肌细胞特异性SpCas9表达小鼠(α-MHC^Cas9),并通过腹腔注射方式将AAV9-sgOga注射到小鼠体内。通过qPCR和Western blot印记杂交实验检测Oga的表达情况,确定Oga敲除是否成功。最后,通过组织学分析心脏结构,以及超声心动图分析心脏功能,来分析Oga对心脏稳态维持的影响。结果 筛选到2条可以有效靶向Oga编码区的sgRNA,通过AAV9递送实现了Oga基因在心脏组织的有效敲除,且导致O-GlcNAcylation表达显著上升;组织学分析和超声心动图分析发现基因敲除小鼠心脏结构及功能在基础水平与对照小鼠无显著变化。结论 利用AAV9介导的CRISPR/Cas9系统成功建立了成体心肌细胞Oga基因敲除的小鼠模型,为研究OGA介导的O-GlcNAcylation清除在心脏稳态维持中的功...     

靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用

目的:设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.方法:采用生物信息学网站设计靶向c-myc基因的gRNA,以GFP作为对照设计GFP gRNA;通过T7E1筛选出编辑效率高的gRNA并将筛选的gRNA构建CRISPR/Cas9腺病毒载体并包装腺病毒,通过分析细胞增殖、周期和凋亡及迁移能力的变化来评估靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统对肝癌的抑制作用.结果:成功设计、构建并包装靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒;靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统能够显著抑制Hepa1-6细胞的增殖和迁移、阻滞细胞周期进程,但对细胞凋亡无影响.结论:靶向c-myc基因的CRISPR/Cas9腺病毒系统可在细胞水平明显抑制肝癌细胞的生长.