D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的诱导表达

利用乳糖代替IPTG作为诱导剂,对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pWY中的D-氨基酸氧化酶进行诱导表达。分别研究了乳糖浓度、菌体浓度、诱导温度、诱导时间对DAAO酶活的影响。结果显示,当菌浓OD600达1.0左右、乳糖浓度为10 g/L、28℃下诱导约6 h,摇瓶发酵得到的DAAO酶活高达2 400 IU/L,     

多次循环离子交换色谱纯化Cry1Ab蛋白及其肽质量谱图的分析

采用Q-Sepharose FF离子交换柱对初步纯化的Cry1Ab杀虫蛋白样品进行了多次循环精细纯化，洗脱模式为离子强度台阶梯度，流动相为Tris-HCl缓冲液加NaCl，盐浓度从0．1mol·L^-1变化到1．0mol·L^-1．结果表明，Cry1Ab蛋白在NaCl浓度为0．4mol·L^-1时从柱上被洗脱，并与杂蛋白很好地分离．色谱分离机制符合顶替色谱机制．经3次循环分离后可获得高纯度的Cry1Ab蛋白．用SDS-PAGE分析了蛋白的纯度及表观分子量，电泳胶上分离的蛋白进行原住酶切后，用基质辅助激光解析-飞行时间质谱对纯化蛋白进行肽质量谱的分析，Mascot数据库搜索结果确证了该纯化蛋白酶解肽段80％符合已知的Cry1Ab蛋白特征肽段．     

褶纹冠蚌(Cristaria plicata)热休克蛋白70的原核表达及多克隆抗体制备

构建褶纹冠蚌热休克蛋白70基因的原核表达质粒pET30a-cpHSP70,并经酶切和DAN测序鉴定。将其转入到表达宿主BL21(DE3)菌中,用IPTG诱导表达,最后用SDS-PAGE和Western-blot检测。结果显示:新表达的重组蛋白分子量约为74kD。在IPTG的诱导下,其表达量随时间的增加而增加,最适表达条件是37℃诱导8h。表达蛋白可溶性分析发现,一部分蛋白以不溶性的包涵体形式存在,一部分蛋白以可溶性蛋白形式存在。Westernblot检测显示蚌在35℃热激诱导1h后,其血、鳃、肌肉、肝胰腺和外套膜组织cpHSP70蛋白表达水平相对于蚌在20℃暂养3h后的表达量明显升高。     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

精氨酸激酶在六氟异丙醇溶液中结构与活性的变化:去折叠平衡态中间体存在的证据

利用内源荧光、1-苯氨基萘-8-磺酸（ANS）荧光、远紫外-圆二色光谱以及酶活力测定等手段研究了精氨酸激酶在1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）溶液中变性后结构与活性的变化．为避免蛋白质聚沉的出现,实验中采用的变性剂浓度低于8％．当六氟异丙醇浓度为0．5％～1．5％时,蛋白质的二级结构和内源荧光发射峰位都没有发生明显的变化,而外源ANS荧光强度则显著增强．继续提高变性剂浓度至6％后,内源荧光发射峰位明显红移、二级结构含量增大、外源荧光减弱、酶活力完全丧失．内源荧光和外源ANS荧光的变化证明：在0．5％～1．5％六氟异丙醇浓度范围内,蛋白质分子以一种结构相对稳定并类似于天然蛋白结构的熔球态中间体的状态存在．这种熔球态中间体也是精氨酸激酶在去折叠过程中出现的一个平衡态中间体．     

HA对铁屑还原去除水中六价铬的影响

采用废铁屑（Fe°）为主要工具修复受污染水体中的六价铬,考察了腐殖酸（HA）对Fe°还原六价铬的影响,并初步探讨了HA存在时,Fe°还原降解水中Cr（VI）的动力学．实验结果表明,HA对铁屑还原去除Cr（VI）存在一定的影响,提高HA浓度会导致Cr（VI）去除效率下降,但是在一定浓度范围内较为接近,当HA浓度提高到80mg·L^-1时,抑制作用较为明显．HA存在时,Fe°还原去除Cr（VI）符合拟一级反应动力学,加入80mg·L^-1的HA,铁屑去除Cr（VI）的反应速率常数相应由不加HA时的0．00481min^-1降低为0．00199min;随着溶液初始pH值由3．0,4．0,6．0增加到10．0,反应速率常数相应由0．02657,0．0091,0．00222min。下降到0．0003min．     

氮、磷、铁对原绿球藻生长的影响

通过单因子试验和正交实验方法研究了N、P、Fe对原绿球藻生长的影响,试验结果表明：在单因子试验中,不同形态N、P、Fe及最佳形态N、P、Fe的不同浓度对原绿球藻生长的影响显著,原绿球藻生长的最佳N盐是NH4Cl,其最佳浓度为20mg·L^-1;最佳P盐是Na2HPO4,其最佳浓度为1．0mg·L^-1;最佳Fe盐是FeCl3,其最佳浓度为0．1mg·L^-1．在正交试验中,当N的浓度为35mg·L^-1、P的浓度为1mg·L^-1、Fe的浓度为0．5mg·L^-1时,原绿球藻生长最快．     

彩色棉再生体系影响因子及抗病基因NP-1转化的研究

选用彩色棉优良品种(棕色)：新彩1号、新彩2号，以下胚轴和子叶作为外植体，确立了5～6日苗龄的彩色棉下胚轴是较好的愈伤组织诱导外植体，不同激素组合及浓度对愈伤组织的诱导有重要作用，2，4—D是愈伤组织诱导中重要的激素，在附加有0．1mol／L2，4—D 0．1mol／LKT的MSB培养基上，诱导形成的愈伤组织质地疏松、生长旺盛，有利于分化为胚性愈伤，比较了不同糖源在愈伤组织诱导中的效应，在蔗糖和葡萄糖为糖源的培养基中，愈伤组织诱导率均为100％，但葡萄糖更有利于愈伤组织的形成和生长，蔗糖的诱导效果次之；麦芽糖和乳糖对愈伤组织的诱导效应不及蔗糖和葡萄糖；甘露醇作为糖源则抑制了愈伤组织的诱导和生长，在胚性愈伤组织的诱导培养中，KNO3加倍和NH4NO3减半的组合利于胚性愈伤组织的发生，在根癌农杆菌介导的抗病基因兔防御素NP—1转化过程中。外植体经农杆菌浸染10min，共培养48h较为合适，在添加头孢霉素500mg／L、卡那霉素50mg／L的培养基中筛选抗性愈伤组织。     

三种草坪草愈伤组织的诱导及其脱水处理后的蛋白分析

研究了匍匐翦股颖、高羊茅和狗牙根3种草坪草愈伤组织诱导情况,愈伤组织诱导率分别为53．0±8．7％、60．7±7．9％和14．7±4．0％,三者的愈伤组织含水量约为91．4±0．3％、94．1±0．4％和93．4±0．2％．经空气干燥法脱水处理,两种冷季型草坪草匍匐翦股颖和高羊茅愈伤组织中18．5kDa和28．7kDa的热稳定蛋白表达量增加．暖季型草坪草狗牙根中18．5kDa的热稳定蛋白表达量增加,而35kDa的热稳定蛋白表达量明显减少．经脱水蛋白的Western Blot检测,脱水处理后3种草坪草中均有脱水蛋白大量积累,分子量从18．5到34．3kDa不等．暖季型和冷季型草坪草在热稳定蛋白和脱水蛋白表达上存在的差异,可能与它们的耐旱机理及耐旱性强弱差异有关．     

天目铁木愈伤组织和芽苗诱导技术

以天目铁木嫩茎尖为外植体,应用均匀设计法筛选其基部愈伤组织诱导和愈伤组织再分化芽苗的最适合培养基.结果表明,最适合的嫩茎尖基部愈伤组织诱导培养基为1/2DR+TDZ 2.30 mg·L^-1+2,4-D 0.55 mg·L^-1,诱导率为93.5%;愈伤组织芽苗再分化培养基为1/2DR+TDZ 3.30 mg·L^-1+KT 0.70 mg·L^-1,分化率达99.8%以上. 成功建立了天目铁木嫩茎尖离体诱导愈伤组织和芽苗再分化体系,且再生芽苗与野生植株染色体数目相同.     

茉莉酸甲酯对杜氏盐藻β-胡萝卜素含量的影响

研究甲基茉莉酸(MeJA)对杜氏盐藻生长、β-胡萝卜素含量及叶绿素含量的影响.在盐藻生长基本培养基中分别添加0μmol.L-1、50μmol.L-1、100μmol.L-1、200μmol.L-1、500μmol.L-1、1 000μmol.L-1和2 000μmol.L-1 MeJA,每隔2 d取样,测定盐藻细胞生长、β-胡萝卜素含量及叶绿素含量.研究结果表明:低MeJA浓度(50~500μmol.L-1)对盐藻的生长无显著的影响,高MeJA浓度(1000~2000μmol.L-1)对盐藻的生长有显著的抑制作用.盐藻β-胡萝卜素及叶绿素含量随着MeJA浓度的升高,呈现先升高后降低的趋势,100μmol.L-1 MeJA处理盐藻时其β-胡萝卜素含量最高,200μmol.L-1 MeJA处理盐藻时其叶绿素含量最高.方差分析结果表明:MeJA对盐藻的生长、类胡萝卜素及叶绿素含量有极显著影响(P0.01),MeJA是诱导盐藻次生代谢产物积累的一个有效的诱导因子.     

新型聚集抑制剂对β-淀粉样蛋白介导的长时程增强抑制的反转

研究探讨了2种Aβ聚集抑制剂在Aβ对LTP的抑制效能上的作用,在海马齿状回上,高频刺激前持续灌流Aβ（500nmol·L-1）40min后,高频刺激诱导的LTP完全被抑制,这种抑制能被M1（5gmol·L-1）和M2（10μmol·L^-1）所反转．中国仓鼠卵细胞自然分泌的人体Aβ在极低的浓度下（1．1μmol·L^-1）也完全抑制了LTP的诱导,此Aβ仅含单体和寡聚体,不合有纤维型和原纤维型．研究表明：寡聚型Aβ形成的阻断可以逆转Aβ对LTP诱导的抑制．这些发现提示阻断寡聚体Aβ形成的药物可以用来治疗AD．     

宁波市内河几种酚类环境激素的污染状况及分布特征

应用固相萃取、超声萃取及高效液相色谱法对宁波市内河10个采样点的壬基酚、辛基酚和双酚A进行了检测. 结果表明: 宁波市内河水体及沉积物中均不同程度地检出了壬基酚和双酚A, 辛基酚的检出率约为50%; 壬基酚、辛基酚和双酚A在内河水体中的浓度最大值分别为4.516μg?L-1、0.384μg?L-1和1.594μg?L-1, 在沉积物(干重)中的含量最大值分别为0.811μg?g-1、0.139μg?g-1和0.223μg?g-1. 江北大河、宁大内河及护城河的水体与沉积物中的浓度值较高, 城湾水库、姚江及后西河相对较低; 水体及沉积物中3种酚类环境激素的浓度值夏季低于冬季, 水体和沉积物中的污染物浓度存在正相关关系. 宁波市内河受到3种酚类环境激素的污染, 对水生生物具有一定的生态风险.     

二氧化钛紫外光在线消解测定COD的研究

以TiO2-K2Cr2O7协同光催化氧化体系为基础，结合流动注射分析方法建立了一种快速测定水样中化学需氧量（COD）的简便方法．该方法测试速度快，不需有毒、昂贵的试剂，具有广阔的应用前景．COD含量在10～100mg·L^-1和100～1000mg·L^-1范围内，吸光度与COD含量均呈良好的线性关系；测定30mg·L^-1和300mg·L^-1的COD标准溶液，RSD≤5．1％（n=7）；将本系统应用于实际环境水样测定，与国家标准分析方法测定结果相符．     

阳离子交换色谱-抑制电导检测法测定过渡金属

采用离子色谱抑制电导检测若干过渡金属离子．由于淋洗液抑制后成中性,过渡金属离子易发生水解形成氢氧化物沉淀而无法采用抑制电导检测,实验中采用在常规强酸淋洗液中加入两性离子,用于控制抑制后淋洗液的pH值．经过实验,在Waters IC-Pak CM／D柱上（150mm×3．9mm,ID）确定淋洗液条件为6．5mmol·L^-1甲基磺酸（MSA）和10mmol·L^-1 4-羟基乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）,Co^2＋、Ni^2＋、Zn^2＋和Cu^2＋等4种过渡金属离子在抑制电导检测下得到了检测信号并与碱金属、铵离子和碱土金属离子获得了较好的分离．在该实验条件下,方法具有较好的灵敏度（检测下限1．31～31．2μg·L^-1）和重现性（时间RSD小于0．86％,峰面积RSD小于5．09％）．     

餐厨垃圾厌氧干发酵产甲烷试验研究

为了探索餐厨垃圾高温干发酵的稳定性运行条件, 采用经三相分离后的餐厨垃圾为原料, 发酵罐污泥为接种污泥, 在高温干式条件下开展连续厌氧发酵产甲烷试验研究. 结果表明, 餐厨垃圾厌氧发酵产甲烷的最佳容积负荷为·(m3·d)-1, 容积产气率为·(m3·d)-1, 原料产气率为·(kg·d)-1, 甲烷体积分数为52.82%. 该厌氧干发酵产甲烷工艺可实现高温度、高含固率且高负荷条件下的稳定运行.