具有真细菌基因启动子活性的古生菌DNA片段

以大肠杆菌启动子探测质粒pKK232-8 为载体,用4 组限制性内切酶分别消化古生菌盐生盐杆菌R1(Halobacterium halobium )的染色体DNA,在体外进行重组,转化E.coliDH-5α感受态细胞,得到12 个转化子(T1～T12),其抗性水平分布在10～500 m g/L的区间内. 将这些转化子所含质粒分别命名为pSX1～pSX12,限制性酶切分析表明,这些质粒各插入了一段不同的外源DNA 片段,杂交分析表明,抗性最强的转化子T11 所含质粒pSX11 上插入了一段来源于盐生盐杆菌R1 染色体的DNA 片段. 该DNA 片段在大肠杆菌中具有启动子功能.     

嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的克隆及其表达

报导了以启动子探测质粒pKK232-8为载体克隆嗜碱芽孢杆菌NTT89启动子的研究.用限制性内切酶Hindl分别消化嗜碱芽孢杆菌NTT89染色体DNA和质粒pKK232-8,在体外重组,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择性平板上筛选转化子,结果从NTT89染色体DNA中克隆到一系列带有启动子活性的DNA片段,并在大肠杆菌中得到表达,这些转化子抗氯霉素水平在34～500mg/L不等,随机挑选10个转化子,提取其重组质粒进行限制性酶切,表明转化子中的重组质粒外源片段插入的效率很高,插入片段大小在500～5500bp之间,通过地高辛标记的点杂交和Southern杂交均证明重组质粒上插入的具启动子功能的DNA片段来自于嗜碱芽孢杆菌的染色体DNA.     

凡纳滨对虾兰尼定受体基因亚克隆文库的构建及部分序列的测定

将一个含有凡纳滨对虾兰尼定受体基因的fosmid克隆用DNA剪切仪进行片段化处理,回收3～5kb之间的DNA片段连接到pUC118HincⅡ/BAP载体上,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆文库.经鉴定,该文库滴度为5.0×104 cfu.mL-1,重组率达到90%,插入片段大小在3～5kb范围内.随机挑取100个阳性克隆进行两端测序,通过拼接得到一条兰尼定受体基因部分片段,该片段长2 550bp.通过比对分析,发现该基因片段推导的氨基酸序列与果蝇兰尼定受体基因有较高的相似性.     

RM07 DNA片段在嗜盐古生菌中的启动子功能研究

以二氢叶酸还原酶基因(dhfr)和β-半乳糖苷酶基因(bgaH)为报告基因，利用启动子探针检测技术研究了在大肠杆菌和酵母菌中均具有启动子活性的RM07DNA片段在嗜盐古生菌中的功能，结果从mRNA转录和蛋白质表达水平证明RM07片段在嗜盐古生菌中同样具有启动子功能．缺失分析进一步定位了RM07片段中启动子活性必需的重要功能区，启动子缺失突变分析的结果与序列结构特征分析的结果相吻合．     

人16周胎儿脑cDNA文库的构建及鉴定

本文从 16周的胎儿脑中抽提总 m RNA,经过一系列酶促反应后合成 c DNA,分级分离柱除去小片段 DNA后克隆到λgt10载体中 ,转染宿主菌 C60 0 hfl,文库包装效率为 4 .2× 10 6pfu/μg,得到的原始克隆数为 2 .1× 10 6,c DNA插入片段平均大于 1.2 kpb.根据已知序列设计引物 ,从这个 c DNA文库中扩增出血管内皮生长因子 ( VEGF)的全长 c DNA基因     

利用噬菌体展示技术制备识别酵母RNR_3原核表达片段的单链抗体

选取酵母细胞RNR_3蛋白序列中高保守片段:145-298位氨基酸序列,命名为RNR_3h进行原核表达.并利用噬菌体展示技术从非免疫小鼠噬菌体展示抗体库中淘选到能与该原核表达产物特异性结合的单链抗体.得到的3种单链抗体均识别原核表达片段的空间抗原位点.为寻找酵母RNR1和RNR_3的诱导表达水平与DNA损伤信号的相互关系,将真核生物RNRs发展为检测环境化学致痛物DNA损伤效应的生物标志物进行了尝试.     

鄱阳湖流域华溪蟹属DNA条形码

探讨DNA条形码分子标记作为华溪蟹属(Sinopotamon)淡水蟹类辅助分类工具的可行性。选取分布于鄱阳湖流域的6种华溪蟹属淡水蟹类78个样本,采用线粒体COI和16SrRNA基因片段以及ITS2核基因片段,作为分子标记,结合GenBank数据库中同属序列片段,经DNA提取、引物筛选、PCR扩增、产物纯化测序及测序数据处理和分析,在计算得到的遗传距离和所构建系统发生树进行华溪蟹DNA条形码标准基因的选择。在本实验涉及的淡水蟹类个体及类群的识别上,16SrRNA和ITS2基因片段不适宜作为DNA条形码标准基因,而COI基因片段结合GenBank部分华溪蟹属序列数据分析,可区分本次研究所涉及的75%的物种。以线粒体COI基因片段为DNA条形码标准序列,可作为华溪蟹属淡水蟹类物种鉴定的辅助分类工具。     

外显子拼接法合成真菌灵芝漆酶基因cDNA

为真菌漆酶基因cDNA的克隆提供了一种简便快速的新方法．从含有内含子的灵芝漆酶基因出发，采用外显子拼接PCR方法，合成了灵芝漆酶的cDNA．设计了10对引物分别经PCR扩增该基因的10个外显子，引物设计使前一个外显子的下游引物与下一个外显子的上游引物都有一段同源匹配序列，然后通过两两片段混合作为模板PCR扩增得到两两拼接的外显子片段，再将得到的5个片段前两个混合，后3个混合分别作为模板扩增获得拼接好的外显子1～4大片段和外显子5～10大片段，最后将这两个大片段混合作为模板扩增得到拼接好的全长cDNA序列．与常规方法相比，该方法既避免了RNA的操作，又不用摸索酶表达的条件，可以和基因组步行技术结合快速获得真菌漆酶基因的cDNA．     

嗜盐嗜碱芽孢杆菌NTT76启动子和信号肽序列的克隆及表达

利用启动子信号肽探测型质粒pGPB14,从嗜盐碱芽孢杆菌NTT76的总基因组中克隆具有启动子和信号肽功能的NDA片段,共得到41个转化子,其氨苄青霉素抗性水平在1000－12000mg/L之间,从3个不同抗性不平的转化子中提取重组质粒,酶切显示,外源插入片段在100－500bp之间,将重组粒质转化枯草芽孢杆菌,也同样使枯草芽孢杆菌具有分泌β－丙酰胺酶的功能,β－丙酰胺酶活力测定表明,大肠杆菌产生的酶主要积累在周质空间,而枯草芽孢杆菌产生的酶主要分泌在胞外,对外源插入片段进行定列测定发现,所有片段均含有启动子区、核糖体结合位点和信号肽编码区域。     

HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯

应用PCR方法扩增出人丙型肝炎病毒全长NS4基因的DNA片段,克隆入表达载体pQE32并转化E.coliJM109.经IPTG诱导表达出42×l03蛋白.利用Ni-NTA-agarose纯化得到纯化产物,Western-blot鉴定该蛋白能够与抗NS4的单克隆抗体发生特异性反应.     

AFLP在水稻线粒体DNA研究中的应用

对 Ａ Ｆ Ｌ Ｐ应用于水稻线粒体基因组研究中的问题进行了研究结果表明： Ａ Ｆ Ｌ Ｐ分析对ｍ ｔ Ｄ Ｎ Ａ 质量要求高,ｍ ｔ Ｄ Ｎ Ａ 应完整并反复抽提以达高纯度 ｍ ｔ Ｄ Ｎ Ａ 不完全酶切所造成的假阳性可经第二次酶切排除选择引物一个选择碱基最适合水稻ｍ ｔ Ｄ Ｎ Ａ Ａ Ｆ Ｌ Ｐ分析 另外,研究表明从银染后未经烘烤的新鲜银染凝胶回收的 Ｄ Ｎ Ａ 扩增效果好、产物经纯化可直接用于克隆以及探针标记     

限制酶Sma I参与的PCR产物克隆技术

介绍了一种增加连接效率的ＰＣＲ产物克隆技术，即ＳｍａＩ内切酶参与的ＰＣＲ产物与ＳｍａＩ酶切的载体的连接；并通过克隆黄鳝基因组中一段约２５０ｂｐ的ＰＣＲ产物的实例证实了该技术的可靠有效性．     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

水稻高温、干旱响应基因OsHdr5的克隆与表达谱分析

低温、高温、干旱等非生物逆境通常会严重影响到水稻的生长及产量.为深入了解水稻逆境反应的分子机理和挖掘耐逆相关基因,本文采用Affymetrix水稻表达芯片对水稻多逆境下的全基因组表达谱进行分析,并筛选出众多表达特异基因.OsHdr5是其中一个在多个生长发育时期与组织器官中受高温、干旱诱导均显著上调的基因,用实时定量PCR方法(real-time PCR)对其表达水平进一步分析,两组结果基本吻合.用PCR方法扩增获得长为743bp的全长基因序列,其ORF区编码167个氨基酸残基,组成的肽链含有磷酸化激酶位点,形成的二级结构包含一个由6个α螺旋和2个β折叠组成的跨膜结构域,进一步分析推测其可能是叶绿体膜上与细胞跨膜信号传递相关的功能蛋白.     

温控表达载体的构建及HIV-1p24的表达与纯化

通过改造原核表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ 和ｐ Ｅ Ｔ２８,构建出了一种新的通用型温控原核表达载体ｐ Ｖ Ｖ５,该载体携带 Ｐｒ Ｐｌ串联温控启动子以及 Ｈｉｓ Ｔａｇ 的纯化标签,利于目的蛋白的表达与纯化将 Ｈ Ｉ Ｖ１ ｇａｇ 基因的１１４８１８５７ 编码序列分别插入到ｐ Ｖ Ｖ５ｂ、ｐ Ｅ Ｔ２８ｂ 的相应位点,构建了重组表达质粒 ｐ Ｅ Ｇ１ｂ、ｐ Ｂ Ｇ７ｂ,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的 ４２％ 和２８％ 表达产物为融合蛋白并主要以包涵体的形式存在 该蛋白 Ｎ 端与含６ 个组氨酸在内的３０ 个氨基酸残基的多肽相连,利用 Ｉ Ｍ Ａ Ｃ金属螯和层析柱,对包涵体中的重组ｐ２４ 蛋白进行纯化, 其纯度超过 ８０％ ;对上清中的可溶性ｐ２４ 蛋白进行纯化,产物最终纯度超过６７％ 纯化后的重组蛋白可与 Ｈ Ｉ Ｖ１ 型标准阳性血清发生较强的免疫学反应     

eglinC基因的化学合成与克隆

采用固相亚磷酰胺法合成了ｅｇｌｉｎＣ全基因，该基因全长２２１ｂｐ，包括其结构基因，５＇－端起始密码子ＡＴＧ和３＇－端终止密码子ＴＡＧ，并在基因的５＇－和３＇－分别装上ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ位点．共分１２个片段，采取分段合成，酶促连接成完整的ｅｇｌｉｎＣ基因．合成的基因克隆于Ｍ１３载体，经杂交、检测，筛选出含ｅｇｌｉｎＣ基因的克隆．用双脱氧链终止法测其序列，结果与设计的一致．     

钩刺山羊草Aegilops triuncialis籽粒硬度主效基因的克隆与表达

根据小皮Pin a，Pin b，GSP基㈥的保守序列，设计合成了3对特异性引物，对四倍体钩刺山羊草Aegilopstriumialis的基因组DNA和胚乳RNA进行Pin a，Pin b，CSP基因扩增、克降、序列测定和表达分析，发现了两个新型Pin a等位堆因、一个新刑Pin b等化基因和一个新型GSP等位基因，基因序列均与六倍体小麦的同源基因存在较大的差异，Southern Blot分析结果表明，该材料巾含有2个拷贝Pin a。基因，5个拷贝Pin b基因，2个拷贝GSP基因．RT-PCR和Western Blot都证实了Pin a，Pin b，GSP基因在籽粒胚乳中的表达．研究结果显示由羊草可以为小麦分子育种提供有用的遗传资源。     

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增ltB和hpaA基因,构建ltB-hpaA融合基因及其原核表达系统,鉴定其表达产物的免疫原性、佐剂活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用.采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和ltB基因片段,构建ltB-hpaA融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.采用质粒pQE32和宿主菌E.coli M15构建ltB-hpaA融合基因表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达.采用western blot和GM1-ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐剂活性.建立HpSS1株感染BALB/c小鼠模型,检测rLTB-HpaA的免疫保护效果.采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况.与GenBank登录的相关序列比较,所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94.25%～99.71%和95.38%～99.19%.所构建的表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15的目的重组蛋白(rLTB-HpaA)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右.rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能产生特异性抗体.GM1-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合.rH-paA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%.81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,所有菌株均含有HpaA.本文成功地构建了itB-hpaA融合基因高效原核表达系统,所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用.     

人巨细胞病毒UL131A,UL130,UL128基因在先天感染患儿临床株中的变异

对18株临床低传代分离株和5株未传代的人巨细胞病毒（HCMV）临床标本分别进行HCMV UL131A，UL130，UL128基因全序列PCR扩增，并进行序列测定及分析．对23株HCMV临床株的UL131A，UL130，UL128基因编码区域进行比较，结果显示此3个基因核苷酸及其编码蛋白是高度保守的，3个基因的核苷酸同源性为96．2％，95．8％，96.0％，编码蛋白的同源性为97．2％，96．6％，96．9％．不同临床症状患儿的HCMV UL131A，UL130，UL128基因及其编码蛋白具有相似的结构．临床株HCMV UL130和UL128基因编码蛋白具有趋化因子的相似结构．所有结果表明临床株中的UL131A，UL130，UL128序列的保守性可能与HCMV在上皮细胞的增殖有关，也与HCMV转移到白细胞和树突状细胞相关．HCMV UL130和UL128基因编码蛋白具有趋化因子的相似结构可能与HCMV的感染相关．