结构光照明超分辨光学显微成像技术与展望

结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy,SIM)通过结构化照明在频率域以空间混频的方式将物体高频信息载入光学系统的探测通带内实现突破衍射极限的超分辨光学显微成像。SIM凭借其较低的激发光强、对荧光染料的非特异性需求以及快速的宽场成像优势已成为活细胞超分辨光学显微成像方面应用最多的技术。本文系统回顾了SIM的技术进展,对SIM的基本原理与实现方法进了详细的分析,重点介绍了本课题组研发的基于光谱分辨的单光子激发超分辨显微镜和结合自适应光学的双光子激发超分辨显微镜这两种最新的SIM技术,最后简要讨论了SIM技术在生物成像中的应用及未来发展方向。     

结构光照明显微中的超分辨图像重建研究

近年来,随着各种新型荧光探针的出现和成像方法的改进,远场光学成像的分辨率已经突破了衍射极限的限制。基于结构光照明的荧光显微技术凭借成像速度快、光毒性弱等优点,已成为目前主流的超分辨成像技术之一。实现结构光照明超分辨显微成像的关键在于照明光场的精准调控和后期的超分辨图像重建算法,否则将会在重建的超分辨图像中产生不可预估的伪影,混淆对观测结构真实形态的判断。详细对比了几种典型的结构光照明显微超分辨重建算法,证明基于图像重组变换的结构光照明超分辨图像重建算法可以有效解决极低结构光场调制度下的超分辨图像重建问题,降低结构光照明显微中的激发光功率。     

基于数字微镜器件的快速超分辨晶格结构光照明显微研究

超分辨结构光照明显微成像技术(super-resolution structured illumination microscopy,SR-SIM)具有时间分辨率高、光漂白和光毒性低和对荧光探针的要求少等优点,适用于活细胞的长时程超分辨成像.采用二维晶格结构光作为照明光,可以实现更快的成像速度和更低的光毒性,但同时也增加了系统的复杂性.为了解决此问题,本文提出了一种基于数字微镜器件的快速超分辨晶格结构光照明显微成像方法(digital micromirror device-based lattice SIM,DMD-Lattice-SIM),通过同步分时触发DMD和sCMOS相机的方式实现二维正交晶格结构光的产生,且只需要采集5幅相移原始图像即可重构出超分辨图像,相比于传统SR-SIM需要9幅相移原始图像的方法,图像采集时间减少了约44.4%.同时,在基于空域和频域联合的SIM重构算法(joint space and frequency reconstruction method-SIM,JSFR-SIM)的基础上,本文还发展了用于LatticeSIM的JSFR超分辨图像重构方法(La...     

结构光照明显微中的偏振控制

结构光照明显微(structured illumination microscopy.SIM)作为一种宽场超分辨光学显微成像技术,具有成像速度快、光漂白和光毒性弱等优点,是目前主流超分辨成像方法之一.在SIM技术中,正弦强度分布的条纹结构光场的对比度决定了SIM超分辨图像的质量.低的条纹对比度将导致样品中超衍射极限的高频信息被噪声掩盖,从而无法解析出超分辨信息.结构照明入射光的偏振态调控决定了干涉条纹的对比度,是SIM的关键技术.鉴于此,本文总结对比了几种典型的SIM系统偏振控制方法,同时提出了一种使用零级涡旋半波片的偏振控制方法.实验证明,与其他方法相比,采用零级涡旋半波片法可以获得更高效的偏振控制效果,具有系统结构简单、易使用、可将光能利用率提升到接近100%的优点.     

结构光照明光切片显微图像的高保真重构方法

光切片图像的质量与使用的重构算法直接相关,传统的均方根算法虽然简洁,但在原始图像信噪比和条纹对比度不高时重构效果不佳,得到的三维重建结果并不理想。针对该问题,提出一种去背景和去卷积相结合的光切片方法。与传统均方根算法相比,该方法能有效减少残留条纹,提高微小细节的可见性。实验搭建了一套基于数字微镜器件的结构照明显微系统,以小鼠肾脏细胞、牛肺动脉内皮细胞等为样品进行了光切片实验。实验结果表明,该方法能获得更好的光切片和三维成像效果。     

显微热成像系统自适应位置标定方法

利用光学微扫描技术,可在不改变探测器结构的情况下,提高显微热成像系统空间分辨率。但为了获得高质量过采样重构图像,微扫描位置需要标定。基于零点定标,提出一种各点自适应定标的微扫描位置标定方法。模拟实际系统在定标前后的欠采样图像,采用不同重构方法进行仿真对比验证;完成了实际采集的欠采样显微热图像序列的重构对比实验。实验结果表明该方法明显改善了显微热成像系统的过采样重构图像质量,提高了系统空间分辨率。此方法还可以应用在其他光电成像系统中。     

基于点扫描结构光的SHG超分辨显微技术研究

二次谐波产生(SHG)成像技术是一种针对非中心对称生物组织的免标记成像技术,已经成为生命科学研究的重要手段。衍射极限使得SHG技术无法分辨衍射极限以下的精细结构。虽然超分辨显微技术取得了突破性进展,但是SHG的相干非线性过程限制了SHG超分辨显微技术的发展。提出了一种点扫描结构光照明SHG超分辨显微(SHG-psSIM)技术,实现了氧化锌颗粒和小鼠尾腱的超分辨SHG显微成像。在传统的SHG显微系统的激发光路中引入电光调制器,通过对激发光正弦调制产生点扫描结构照明图案。基于点扫描结构照明图案与样本结构相互作用产生的莫尔条纹效应,将原本不可探测的样本高频信息搬移到显微镜通频带内,并利用光电倍增管探测。最后,利用软件重构出超分辨率图像。对比传统SHG系统,SHG-psSIM分辨率提高了1.86倍。     

平场复用多焦点结构光照明超分辨显微成像

多焦点结构光照明显微技术(multifocal structured illumination microscopy, MSIM)能在50μm的成像深度内和1Hz的成像速度下实现两倍于衍射极限分辨率的提升,相比传统的宽场结构光照明显微技术,具有较大的成像深度和层析能力,更适合应用于厚样品的长时程三维超分辨成像.然而, MSIM存在成像速度慢、图像处理过程复杂等问题.本文提出了一种基于平场复用多焦点结构光照明的快速超分辨显微成像方法和系统(flat-field multiplexed MSIM, FM-MSIM),通过在照明光路中插入光束整形器件,将高斯光束转变为均为分布的平顶光束,提高激发点阵的强度均匀性和扩大视场;通过将每个衍射受限的激发点沿y方向延长,形成新的多路复用多焦点阵照明图案,提高能量利用率,减少扫描步数,进而提高成像速度和信噪比;结合基于多重测量矢量模型的稀疏贝叶斯学习图像重构算法,简化图像重构步骤,在保证空间分辨率的同时实现至少4倍于传统MSIM的成像速度.在此基础上,利用搭建的FM-MSIM系统进行了BSC细胞微管样片和小鼠肾切片标准样片的超分辨成像实验,实验结果证明...     

基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微

在传统共聚焦显微技术的基础上,图像扫描显微技术使用面阵探测器来代替单点探测器,结合虚拟数字针孔并利用像素重定位和解卷积图像重构算法将传统宽场显微镜的分辨率提高一倍,实现了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐点扫描的方式,三维成像速度相对较慢,限制了其在活体样品成像中的应用.为了进一步提高图像扫描显微术的成像速度,本文提出了一种基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微成像方法和系统.在照明光路中,利用高速数字微镜器件产生周期分布的聚焦点阵对样品进行并行激发和快速二维扫描;在探测光路中,利用双螺旋相位片将激发点荧光信号的强度分布转换为双螺旋的形式;最终,利用后期数字重聚焦处理,从单次样品扫描数据中重构出多个样品层的超分辨宽场图像.在此基础上,利用搭建的系统分别对纤维状肌动蛋白和海拉细胞线粒体进行成像实验,证明了该方法的超分辨能力和快速三维成像能力.     

用于彩色光照粒子图像测速的粒子场模拟成像

分析了基于彩色光照的粒子图像测速算法中示踪粒子的成像原理,并根据实际流场中的应用环境以及彩色粒子图像测速算法的实验条件,采用一套由白色光源和波长线性变化的滤波片组成的照明系统,为粒子场提供不同深度、相同光强的彩色体积光照明.根据针孔相机模型和其对应的点扩散函数,建立示踪粒子的三维成像模型,得到在彩色体积光照射下流场中的...     

基于相移结构光照明的浮雕成像技术研究

详细介绍了一种基于相移结构光照明的浮雕成像技术,对该成像技术的原理和成像特性进行了实验研究,并采用相移结构光照明的方法实现彩色浮雕成像。实验中,将多幅相移正弦条纹光场斜投射到被拍摄物体上,数码相机依次拍摄被照明的物体,再利用拍摄到的多幅相移图像,通过计算的方法重建出所需要的图像。理论分析和实验结果表明,相移结构光照明成像技术能有效地消去环境不均匀光照的影响,获取的反射率分布图像只与结构光照明有关,突显了斜投射照明所形成的阴影,图像的明暗变化反映出物体表面的法线变化,因而在视觉上形成了明显的浮雕效果。     

自适应激光共焦高速扫描显微成像错位校正算法

往复式逐行扫描是一种提高激光共焦扫描显微成像帧速的有效方式,然而随着帧速的提高,这种扫描方式在图像重构时会带来更严重的图像错位。根据高速振镜运动特性,分析了激光共焦高速扫描显微成像系统逐行扫描下的重构图像错位原理,设计了基于形态学梯度的重构图像错位评价算法,并且结合搜索错位评价最小点的单目标约束粒子群算法实现了重构图像错位校正。经实验验证,该算法适用于成像帧速高达300 frame/s的重构图像错位校正;与未进行错位校正的图像相比,校正后的成像分辨率提高了68.83%,同时该算法能够适用于不同振镜搭配方式和不同扫描帧速的图像重构。     

结构光照明相位/荧光双模式显微技术

本文提出了一种基于结构光照明的高分辨相位/荧光双模式显微成像方法.该方法利用一数字微镜阵列(DMD)产生条纹结构光,并记录样品在结构光照明下的全息图像和荧光图像,最终可以重建出样品的定量相位图像和超分辨荧光图像.此外,还提出了一种补偿环境扰动对相位成像影响的数值方法,提高了成像系统的抗干扰能力.在该双模式成像系统中,定量相位成像和荧光成像的空间分辨率分别为840 nm和440 nm,为同一样品提供互补信息.该方法有望被广泛应用于生物医学、工业和化学等诸多领域.     

隐形结构光三维成像动态背景光干扰抑制技术

结构光照明成像在近距离高分辨率物体三维测量方面具有重要应用。在传统结构光照明成像的基础上,提出了隐形结构光三维成像动态背景光干扰抑制技术,对实际目标进行了三维轮廓获取,并对动态背景光的抗干扰能力进行了详细的分析和验证。基于激光干涉原理产生的结构光,投射两束正交偏振光束到物体表面并不产生干涉条纹,采用同步相移探测技术实现结构光条纹的探测和再现。采用同步相移探测技术,可同时获得4步相移条纹图像,有效降低了背景光的干扰,提升了动态三维成像的能力。理论研究了隐形结构光的成像原理及动态背景光抑制机理,搭建了实验验证装置,获得了动态背景光干扰下实际目标的三维重建图像,实验结果与理论分析吻合。     

无透镜显微成像的重构算法研究

针对单幅图像进行了无透镜显微成像的重构算法研究，介绍了无透镜显微成像系统实验装置和ASM(angle spectrum method)、改编后的L-R(Lucy-Richardson)两种重构算法。对比两种算法重构后的USAF分辨率板图像的分辨率，利用瑞利判据得出ASM获得的振幅图分辨率最高(即3.10 μm)，且计算用时最少(即0.9 s)，证明了ASM为最佳的单幅无透镜显微重构算法。其次，利用无透镜显微成像系统结合ASM重构的方法，进行细胞成像实验。该无透镜成像视场为5×显微镜的4.4倍，且分辨率介于5×及10×光学显微镜之间，统计学优势明显，在生物医学领域具有广阔的应用前景。     

结构导向的可逆光激活绿色荧光蛋白探针的研制

近几年,可逆光激活荧光蛋白的研制越来越受到人们的重视,这类荧光蛋白极大地促进了活细胞超高分辨显微成像技术的发展及应用。可逆光激活荧光蛋白可被不同波长的光多次可逆地进行调制,因而被广泛地应用于高密度数据的光存储、光致变色荧光共振能量转移的测量以及基于可逆饱和线性荧光跃迁原理的超高分辨率显微成像中。从研制这类荧光蛋白所涉及的关键氨基酸位点出发,本文综述了近几年可逆光激活绿色荧光蛋白的研制进展,并简要地讨论荧光蛋白结构与光学特性的关系,从而为后续结构导向的可逆光激活荧光蛋白的研制提供参考。     

散射光声探测技术及其成像方法

为了实现强散射样品的光声显微成像,提出了一种散射光声显微成像新技术。利用散射光声效应原理,成功设计研制了散射光声探测器。散射光声探测器由散射光声腔、耦合腔、微通道以及微音器组成。利用该探测器探测样品的散射光声信号,然后结合共焦扫描成像技术实现了强散射样品的光声显微成像,获得了二氧化硅微球和口腔上皮细胞等各种不同散射样品的光声显微图像。实验结果表明,散射光声显微成像技术可以极大地改善图像对比度和增强图像边缘,对于工业、大气等方面的微粒直径测量具有重要的应用意义。     

光学微扫描显微热成像扫描零点定标方法研究

为改善已研制光学微扫描显微热成像系统的空间分辩力,微扫描零点需要确定.基于几何原理,研究提出了一种利用数字图像处理技术进行零点定标的方法.给出了微扫描零点的定义、详细分析了零点定标原理及方法,完成了实际显微热成像系统的微扫描零点定标.针对红外热图像,模拟零点定标前后的实际系统,采用不同重构方法进行了仿真研究,给出了评价参数;利用零点定标后的光学微扫描显微热成像系统采集低分辨力显微热图像序列进行过采样重构研究,仿真和实验结果表明了该方法的有效性,从而得到了高分辨力光学微扫描显微热成像系统,可应用于需要显微热分析的场合.     

显微热成像系统像素相关度插值微扫描图像重建技术

显微热成像技术根据温度变化对细微目标进行热成像,是国内外光电成像领域重要的研究方向.由于加工技术精度有限,前期研制的光学微扫描显微热成像系统存在扫描位置误差,该误差使基于微扫描图像直接融合形成的图像质量下降.提出一种结合图像预处理思想、微扫描原理和通过计算像素相关度进行微扫描图像插值重建的算法.仿真及实验表明:方法能改...     

最近邻域与无邻域算法结合空间滤波实现显微光切片

运用最近邻域与无邻域算法,并结合空间滤波方法,可去除显微切层图像的离焦模糊成份,可获得高成像速度、高质量的显微光切片。对各种显微图像进行了光切片处理,并与由现有去卷积处理、结构光照明等方法获得的光切片图像进行了对比,验证了该算法在去除模糊信息方面有更好的效果,提高了图像处理效率,获得了令人满意的光切片图像。在此基础上研制出了显微光切片图像处理系统。运用最近邻与无最近邻算法,结合空间滤波方法,采用简便可调的卷积模糊算子代替点扩散函数的估计过程,图像处理方便快捷,可较好地去除离焦平面的模糊信息。