结构光照明显微中的超分辨图像重建研究

近年来,随着各种新型荧光探针的出现和成像方法的改进,远场光学成像的分辨率已经突破了衍射极限的限制。基于结构光照明的荧光显微技术凭借成像速度快、光毒性弱等优点,已成为目前主流的超分辨成像技术之一。实现结构光照明超分辨显微成像的关键在于照明光场的精准调控和后期的超分辨图像重建算法,否则将会在重建的超分辨图像中产生不可预估的伪影,混淆对观测结构真实形态的判断。详细对比了几种典型的结构光照明显微超分辨重建算法,证明基于图像重组变换的结构光照明超分辨图像重建算法可以有效解决极低结构光场调制度下的超分辨图像重建问题,降低结构光照明显微中的激发光功率。     

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。     

超分辨成像及超分辨关联显微技术研究进展

光学成像系统中有限孔径对光波的衍射,使得光学显微成像技术的分辨率受到"衍射极限"限制而无法进一步提高.自1873年E.K.Abbe提出该问题以来,衍射极限就一直是学术界研究的热点.近年来,随着高强度激光、高灵敏探测器等光电器件研制技术以及新型荧光探针开发等相关领域的快速发展,光学显微技术衍射极限问题的研究迎来了新的契机,超分辨显微成像技术(super-resolution microscopy.SRM)在近十年内取得了令人瞩目的巨大成就.本文从空域和频域角度回顾了衍射极限分辨率的基本原理,并据此对目前常见的各种SRM技术"绕过"衍射极限提高分辨率的机理给予了详解,同时介绍了各类技术的发展动态和研究方向;作为SRM的一个新的重要的发展趋势,本文详细介绍了超分辨关联显微技术的最新研究进展,包括SRM与活细胞实时荧光显微、荧光寿命显微、光谱测量和成像、电子显微、原子力显微、质谱技术等的关联,着重讨论了各类超分辨关联显微技术的作用和意义;最后,对SRM技术和超分辨关联显微技术的未来发展方向进行了展望.     

超分辨荧光显微成像染料结构与生物应用（特邀）

荧光显微成像技术的生物医学应用离不开荧光染料的设计与开发。有机小分子荧光染料因其易于修饰、生物相容性好、光物理性质优异等特点,在细胞生物成像领域受到了广泛关注。随着超分辨荧光显微镜的发展和技术的进步,使得荧光显微成像突破了光学衍射极限,可以获得更为精准的生物分子学信息,观察纳米尺度下亚细胞器之间的相互作用。根据不同的成像原理,科学家开发出了单分子定位成像技术、受激辐射损耗成像技术、结构光照明技术等超分辨荧光显微技术。这些技术在细胞荧光显微成像领域的应用与发展,同时对有机小分子荧光染料的设计与开发提出了新要求。本文介绍了主流超分辨荧光显微技术的原理,总结已发表的超分辨荧光显微成像荧光染料的结构和光物理性质特点,归纳了其设计要求,旨在为新型荧光染料的设计提供参考。     

双色荧光辐射差分超分辨显微系统研究

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用,使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像,本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像,以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后,本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明,在488 nm和640 nm激发光下,该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率,另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像,满足了实际应用的要求。     

基于点扫描的超分辨显微成像进展

光学显微镜一直推动着现代科学技术的发展.随着科学的进步,对显微成像分辨率的要求在生物、材料等领域日渐凸显,而常规宽场显微成像一直面临着成像分辨率衍射受限的问题.1968年出现的共聚焦显微镜作为点扫描显微镜的开端第一次实现了远场下成像分辨率的突破,它具有层切性好、信噪比高等优点.在1994年出现的受激辐射荧光损耗显微镜将显微成像能力突破到2.8 nm左右,并成为目前效果最佳、应用较广泛的超分辨显微技术.荧光差分显微和饱和荧光吸收竞争等点扫描技术具有无荧光染剂限制、饱和光强低、光路简单等优势,并且能取得1/6波长的分辨能力,进而在超分辨显微领域仍有着发挥空间.Airyscan技术作为以上方法的补充可以弥补点扫描系统中由于探测小孔半径减小而带来的信号丢失,从而提高成像信噪比和分辨率,但阵列探测器成本较高.上述点扫描显微镜通过改变照明或者探测的方式实现了分辨率突破.本文详细讨论了点扫描超分辨方法的原理、成像效果及面临的瓶颈,并分析了点扫描超分辨显微镜在应用和技术上的趋势.     

用于细胞脂滴超分辨荧光成像的有机荧光探针研究进展

脂滴是真核细胞中必不可少的一种球形细胞器,与很多细胞生理学过程息息相关。荧光成像技术是观察研究脂滴最有力的工具之一。受光学衍射极限的限制,传统的宽场以及共聚焦显微镜所能达到的成像分辨率约为250 nm左右,这对于观测小脂滴,尤其是新生脂滴（尺寸约30～60 nm）来说是远远不够的。在这种情况下,近年来新兴的各种能够打破衍射极限的超分辨荧光显微镜（如受激发射损耗显微镜、结构光照明显微镜以及光激活定位显微镜等）逐渐吸引了科研人员的兴趣。为了得到高分辨率脂滴荧光图像,除了上述超分辨显微镜之外,还需要具有与之相匹配的高性能荧光探针。本文将简要介绍这几种超分辨显微镜的工作原理,讨论其对荧光探针光物理性质的特殊要求,并进一步系统总结脂滴超分辨成像荧光探针的研究进展。与此同时,本文将分析对比不同超分辨显微镜在脂滴荧光成像方面的优势与不足,并对其发展趋势进行展望。     

基于点扫描结构光的SHG超分辨显微技术研究

二次谐波产生(SHG)成像技术是一种针对非中心对称生物组织的免标记成像技术,已经成为生命科学研究的重要手段。衍射极限使得SHG技术无法分辨衍射极限以下的精细结构。虽然超分辨显微技术取得了突破性进展,但是SHG的相干非线性过程限制了SHG超分辨显微技术的发展。提出了一种点扫描结构光照明SHG超分辨显微(SHG-psSIM)技术,实现了氧化锌颗粒和小鼠尾腱的超分辨SHG显微成像。在传统的SHG显微系统的激发光路中引入电光调制器,通过对激发光正弦调制产生点扫描结构照明图案。基于点扫描结构照明图案与样本结构相互作用产生的莫尔条纹效应,将原本不可探测的样本高频信息搬移到显微镜通频带内,并利用光电倍增管探测。最后,利用软件重构出超分辨率图像。对比传统SHG系统,SHG-psSIM分辨率提高了1.86倍。     

多色虚拟荧光辐射差分显微成像

荧光辐射差分显微成像是一种荧光染料普适性强、光毒性较低的超分辨成像技术。然而传统荧光辐射差分成像由于受其成像原理限制,系统复杂度较高、稳定性低且成像速度受限。针对上述问题,本文设计搭建了一套多色虚拟荧光差分显微系统,并对该系统的成像方法和参数间的制约关系进行了分析,基于已有的多色虚拟荧光辐射差分显微术原理,进一步考虑了信噪比和背景噪声等的影响,建立了可通过实验验证的虚拟荧光辐射差分显微成像模型。实验表明,本系统与方法具有结构简单、背景去噪能力强、荧光染料普适性强以及光毒性低等特性,成像分辨率较共聚焦系统提升了1.9倍,成像速度较传统的荧光辐射差分显微系统提升一倍,在3个波长上均获得了良好的成像效果,并在生物细胞成像中得到实验验证。     

单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望(特邀综述)

随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.     

受激辐射损耗超分辨显微成像系统研究的新进展

由于受到衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率被限制在半个波长左右.近二十年来出现了许多通过不同方法绕过光学衍射极限的超分辨成像技术,其中,受激辐射损耗显微(stimulated emission depletion microscopy,STED)通过引入一束环形损耗光来抑制荧光光斑外围荧光分子的发光,以达到减小点扩散函数的目的,实现超分辨成像.经过近些年的发展,STED系统无论从光束的产生、校准和扫描,还是最后的成像,都有了很大的发展.本文将简要介绍STED成像技术的基本原理,详述STED超分辨成像技术出现至今在光源、扫描及成像系统等方面的进展,以及在三维成像和多色成像方面的发展现状,STED技术与其他显微技术的结合.最后,本文对STED技术近几年的研究新进展进行了系统的论述,对STED技术未来的发展趋势进行了探讨.     

荧光显微光谱成像系统及教学设计

本文介绍了一种自组荧光显微光谱成像系统。该系统性能稳定、功能多样,可以实现空间显微分辨和光谱探测功能的有机结合,具有白光照明成像、激光激发荧光成像、显微光谱成像、荧光光谱探测和应力调控等功能。实验结果表明,该系统的光学分辨率385nm,光谱分辨率小于1nm,可以完成量子点和单层二维材料的荧光光谱探测、白光照明成像和显微光谱成像等。依托该系统设计开展的实验内容充足、层次分明,可满足不同学生的学习需求,为目前国内荧光光谱相关的物理实验教学提供思路。     

结构光照明相位/荧光双模式显微技术

本文提出了一种基于结构光照明的高分辨相位/荧光双模式显微成像方法.该方法利用一数字微镜阵列(DMD)产生条纹结构光,并记录样品在结构光照明下的全息图像和荧光图像,最终可以重建出样品的定量相位图像和超分辨荧光图像.此外,还提出了一种补偿环境扰动对相位成像影响的数值方法,提高了成像系统的抗干扰能力.在该双模式成像系统中,定量相位成像和荧光成像的空间分辨率分别为840 nm和440 nm,为同一样品提供互补信息.该方法有望被广泛应用于生物医学、工业和化学等诸多领域.     

微球透镜超分辨显微成像与检测技术综述

受衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率最高约为波长的一半,突破衍射极限,获得更高的成像分辨率是近年来显微成像领域的研究热点。相比于其他超分辨显微成像方式,基于微球透镜的超分辨显微成像方式具有简单直接、免标记等优点。主要介绍国内外研究团队将微球与传统的光学显微镜结合实现超分辨显微成像的研究进展,从微球透镜参数选择、成像方案、成像分辨率、成像视场及成像机理等多角度进行总结与比对;并结合课题组工作,介绍了将微球透镜与干涉显微技术相结合的三维超分辨检测技术,阐述了Linnik型与Mirau型两种检测光路原理,分析了三维超分辨检测的效果;展望了微球透镜超分辨显微技术在显微成像与显微干涉检测两个方面待解决的问题与发展方向。     

受激发射损耗显微中空心损耗光的光强分布优化研究

受激发射损耗显微技术(STED)作为一种远场超分辨显微成像技术,具有几十纳米甚至几纳米的空间分辨率,是细胞生物学等研究领域的重要成像工具。圆环形空心损耗光在物镜焦点附近的光场强度分布对STED空间分辨率起决定性作用。在高数值孔径物镜聚焦下,光场的偏振态会对聚焦光场的强度分布产生显著的影响,此外,显微系统的轴外像差会严重破坏空心损耗光焦斑的中心对称性。基于矢量衍射理论,理论模拟了在高数值孔径物镜聚焦条件下,入射涡旋光的偏振态和光学系统中的彗差和像散对空心损耗光焦场强度分布的影响。实验上使用纯相位型空间光调制器来校准光学系统相差,优化变形的损耗光,利用纳米探针扫描焦点区域,测量了其焦场强度分布。测量结果与由矢量稍微理论观测的结果一致。     

结构光照明超分辨光学显微成像技术与展望

结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy,SIM)通过结构化照明在频率域以空间混频的方式将物体高频信息载入光学系统的探测通带内实现突破衍射极限的超分辨光学显微成像。SIM凭借其较低的激发光强、对荧光染料的非特异性需求以及快速的宽场成像优势已成为活细胞超分辨光学显微成像方面应用最多的技术。本文系统回顾了SIM的技术进展,对SIM的基本原理与实现方法进了详细的分析,重点介绍了本课题组研发的基于光谱分辨的单光子激发超分辨显微镜和结合自适应光学的双光子激发超分辨显微镜这两种最新的SIM技术,最后简要讨论了SIM技术在生物成像中的应用及未来发展方向。     

大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统

现代生物学和生物医学领域迫切需要研制兼顾大视场、高分辨率的显微成像技术和仪器以对生物样品实现跨尺度观测,满足重大科学问题的研究需求。受限于系统的空间带宽积,传统商业显微镜无法满足这一需求,且现有高空间带宽积显微成像系统存在体积庞大、实施成本高昂等问题。本文基于HiLo光切片技术和自主设计的大视场高分辨显微物镜,研发了具有高空间带宽积特点的大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统,测试了系统的成像视场和分辨率。应用该系统对小鼠脑切片开展了白光照明明场成像实验,并与OLYMPUS商业显微镜成像结果做了对比;对小麦种子荧光切片开展了光切片成像和宽场荧光成像对比实验。实验结果表明,大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统的成像视场达到4.8 mm×3.6 mm (对角视场为6.0 mm),横向分辨率达到0.74μm,轴向分辨率达到4.16μm。大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统兼有大视场和高分辨率成像的优势和快速光切片成像的能力,能够对大体积生物样本开展快速三维成像,将为胚胎发育、脑成像、数字病理诊断等研究提供有力的技术支撑。     

结构导向的可逆光激活绿色荧光蛋白探针的研制

近几年,可逆光激活荧光蛋白的研制越来越受到人们的重视,这类荧光蛋白极大地促进了活细胞超高分辨显微成像技术的发展及应用。可逆光激活荧光蛋白可被不同波长的光多次可逆地进行调制,因而被广泛地应用于高密度数据的光存储、光致变色荧光共振能量转移的测量以及基于可逆饱和线性荧光跃迁原理的超高分辨率显微成像中。从研制这类荧光蛋白所涉及的关键氨基酸位点出发,本文综述了近几年可逆光激活绿色荧光蛋白的研制进展,并简要地讨论荧光蛋白结构与光学特性的关系,从而为后续结构导向的可逆光激活荧光蛋白的研制提供参考。     

基于环形光瞳提高荧光辐射差分超分辨显微镜的成像分辨率

荧光辐射差分(FED)显微术利用实心光斑扫描的一幅共聚焦图像减去空心光斑扫描的负共聚焦图像,实现了超分辨成像。使用简单的环形光瞳滤波器提高了无变形FED的成像分辨率。在空心焦斑光路上使用合适的环形光瞳滤波器,压缩空心焦斑的尺寸;同时,在实心焦斑的光路上允许使用更高数值孔径的孔径光阑,获得更小的、与空心焦斑相匹配的实心光斑分布:两方面作用下,提高了FED的空间分辨率。     

基于数字微镜器件的快速超分辨晶格结构光照明显微研究

超分辨结构光照明显微成像技术(super-resolution structured illumination microscopy,SR-SIM)具有时间分辨率高、光漂白和光毒性低和对荧光探针的要求少等优点,适用于活细胞的长时程超分辨成像.采用二维晶格结构光作为照明光,可以实现更快的成像速度和更低的光毒性,但同时也增加了系统的复杂性.为了解决此问题,本文提出了一种基于数字微镜器件的快速超分辨晶格结构光照明显微成像方法(digital micromirror device-based lattice SIM,DMD-Lattice-SIM),通过同步分时触发DMD和sCMOS相机的方式实现二维正交晶格结构光的产生,且只需要采集5幅相移原始图像即可重构出超分辨图像,相比于传统SR-SIM需要9幅相移原始图像的方法,图像采集时间减少了约44.4%.同时,在基于空域和频域联合的SIM重构算法(joint space and frequency reconstruction method-SIM,JSFR-SIM)的基础上,本文还发展了用于LatticeSIM的JSFR超分辨图像重构方法(La...