荧光蛋白与超分辨显微成像

超分辨显微成像技术使细胞生物学进入到了一个全新的时代,但如何进一步提高超分辨显微成像技术的时空分辨率仍是光学领域需要解决的重要问题。目前为止几乎所有的超分辨显微成像技术都依赖于荧光探针,光调控荧光蛋白作为一类特殊的荧光探针,可以被不同波长的激发光所激活,产生随机或者特殊结构样式的信号。利用这些信息,透镜系统的空间分辨率得到了提高。通过总结光调控荧光蛋白的各类参数,从荧光探针入手,寻找进一步提高成像系统空间分辨率的方法与策略,为选取适当的荧光探针提供建议,并且阐述了荧光蛋白与超分辨显微成像技术之间的关系。     

基于激光干涉的结构光照明超分辨荧光显微镜系统

结构光照明荧光显微术(SIM)是一种可突破阿贝衍射极限的宽场显微成像技术,因其非侵入、成像速度快及光损伤小等优点在生物医学研究中具有广泛的应用前景。从结构光照明显微成像系统基本原理出发,分析了超分辨图像重构算法原理、重构图像中伪影来源及优化方法;结合研制的线性/非线性结构光照明显微镜,详细讨论了基于激光干涉的SIM成像系统光机结构。重点讨论了系统的同步时序设计和光路中的几个关键技术问题。设计对比实验验证了自主开发的SIM重构算法的可靠性,并基于研制的线性SIM系统开展细胞骨架的成像实验。最后,对SIM技术在生物上的发展和应用提出展望。     

超分辨荧光显微成像染料结构与生物应用（特邀）

荧光显微成像技术的生物医学应用离不开荧光染料的设计与开发。有机小分子荧光染料因其易于修饰、生物相容性好、光物理性质优异等特点,在细胞生物成像领域受到了广泛关注。随着超分辨荧光显微镜的发展和技术的进步,使得荧光显微成像突破了光学衍射极限,可以获得更为精准的生物分子学信息,观察纳米尺度下亚细胞器之间的相互作用。根据不同的成像原理,科学家开发出了单分子定位成像技术、受激辐射损耗成像技术、结构光照明技术等超分辨荧光显微技术。这些技术在细胞荧光显微成像领域的应用与发展,同时对有机小分子荧光染料的设计与开发提出了新要求。本文介绍了主流超分辨荧光显微技术的原理,总结已发表的超分辨荧光显微成像荧光染料的结构和光物理性质特点,归纳了其设计要求,旨在为新型荧光染料的设计提供参考。     

多色虚拟荧光辐射差分显微成像

荧光辐射差分显微成像是一种荧光染料普适性强、光毒性较低的超分辨成像技术。然而传统荧光辐射差分成像由于受其成像原理限制,系统复杂度较高、稳定性低且成像速度受限。针对上述问题,本文设计搭建了一套多色虚拟荧光差分显微系统,并对该系统的成像方法和参数间的制约关系进行了分析,基于已有的多色虚拟荧光辐射差分显微术原理,进一步考虑了信噪比和背景噪声等的影响,建立了可通过实验验证的虚拟荧光辐射差分显微成像模型。实验表明,本系统与方法具有结构简单、背景去噪能力强、荧光染料普适性强以及光毒性低等特性,成像分辨率较共聚焦系统提升了1.9倍,成像速度较传统的荧光辐射差分显微系统提升一倍,在3个波长上均获得了良好的成像效果,并在生物细胞成像中得到实验验证。     

结构光照明相位/荧光双模式显微技术

本文提出了一种基于结构光照明的高分辨相位/荧光双模式显微成像方法.该方法利用一数字微镜阵列(DMD)产生条纹结构光,并记录样品在结构光照明下的全息图像和荧光图像,最终可以重建出样品的定量相位图像和超分辨荧光图像.此外,还提出了一种补偿环境扰动对相位成像影响的数值方法,提高了成像系统的抗干扰能力.在该双模式成像系统中,定量相位成像和荧光成像的空间分辨率分别为840 nm和440 nm,为同一样品提供互补信息.该方法有望被广泛应用于生物医学、工业和化学等诸多领域.     

结构光照明显微中的超分辨图像重建研究

近年来,随着各种新型荧光探针的出现和成像方法的改进,远场光学成像的分辨率已经突破了衍射极限的限制。基于结构光照明的荧光显微技术凭借成像速度快、光毒性弱等优点,已成为目前主流的超分辨成像技术之一。实现结构光照明超分辨显微成像的关键在于照明光场的精准调控和后期的超分辨图像重建算法,否则将会在重建的超分辨图像中产生不可预估的伪影,混淆对观测结构真实形态的判断。详细对比了几种典型的结构光照明显微超分辨重建算法,证明基于图像重组变换的结构光照明超分辨图像重建算法可以有效解决极低结构光场调制度下的超分辨图像重建问题,降低结构光照明显微中的激发光功率。     

大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统

现代生物学和生物医学领域迫切需要研制兼顾大视场、高分辨率的显微成像技术和仪器以对生物样品实现跨尺度观测,满足重大科学问题的研究需求。受限于系统的空间带宽积,传统商业显微镜无法满足这一需求,且现有高空间带宽积显微成像系统存在体积庞大、实施成本高昂等问题。本文基于HiLo光切片技术和自主设计的大视场高分辨显微物镜,研发了具有高空间带宽积特点的大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统,测试了系统的成像视场和分辨率。应用该系统对小鼠脑切片开展了白光照明明场成像实验,并与OLYMPUS商业显微镜成像结果做了对比;对小麦种子荧光切片开展了光切片成像和宽场荧光成像对比实验。实验结果表明,大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统的成像视场达到4.8 mm×3.6 mm (对角视场为6.0 mm),横向分辨率达到0.74μm,轴向分辨率达到4.16μm。大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统兼有大视场和高分辨率成像的优势和快速光切片成像的能力,能够对大体积生物样本开展快速三维成像,将为胚胎发育、脑成像、数字病理诊断等研究提供有力的技术支撑。     

线结构光共焦显微成像技术的实验研究

激光共焦扫描显微镜大多采用点共焦扫描成像形式,扫描机构复杂,成本高。新型的线结构光共焦显微成像技术是对样品进行线共焦成像,只需对样品进行一维扫描就可以得到整个平面的像。设计了线结构光共焦成像实验装置,进行了线结构光共焦显微成像实验。实验结果证明了线结构光共焦成像的可行性,杂散光明显地减少,提高了成像清晰度,并且有光学层析能力。采用低照度高分辨率CCD代替价格昂贵的像增强器大大降低了系统成本。     

散射光声探测技术及其成像方法

为了实现强散射样品的光声显微成像,提出了一种散射光声显微成像新技术。利用散射光声效应原理,成功设计研制了散射光声探测器。散射光声探测器由散射光声腔、耦合腔、微通道以及微音器组成。利用该探测器探测样品的散射光声信号,然后结合共焦扫描成像技术实现了强散射样品的光声显微成像,获得了二氧化硅微球和口腔上皮细胞等各种不同散射样品的光声显微图像。实验结果表明,散射光声显微成像技术可以极大地改善图像对比度和增强图像边缘,对于工业、大气等方面的微粒直径测量具有重要的应用意义。     

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。     

小型化望远式激光共焦扫描显微内窥镜

研制了一种激光共焦扫描显微内窥镜,采用望远式显微内窥光学系统,同时实现长距离的图像中继传输、远心f-theta光学扫描和显微内窥成像功能.二维共焦扫描由双振镜实现,低噪音扫描控制信号由嵌入式系统产生.为实现便携式应用,激光共焦扫描显微内窥镜采用小型化设计方案.首先,体内的显微内窥成像光学系统,外径尺寸为8 mm,工作长度为250.3 mm,可通过标准腹腔镜手术孔进行体内显微内窥成像;其次,采用3 mm通光孔径的小尺寸平面反射镜实现体外共焦扫描,摆动频率为100 Hz,实现快速共焦扫描;最后,激光控制和荧光探测仅通过电缆和光纤与共焦扫描显微内窥镜前端连接,减小了显微内窥镜的前端尺寸和重量.通过实验验证,本系统的成像视场为φ 600 μm,光学分辨率为2.2 μm,可采用手持式或者其他方式工作,进行体内组织的共焦扫描成像,实现微创、在体的荧光显微内窥术.     

一种新型双光子激发荧光开关

本刊讯绿色荧光蛋白是近几十年来生物医学研究热点，并在2008年获得诺贝尔化学奖。实际上，通过基因重组可以得到蓝、绿、橙和红等各种不同颜色的荧光蛋白，还可以得到具有光响应或光开关的荧光蛋白。与普通荧光蛋白比较，光响应荧光蛋白表现出光致变色荧光或光致可逆荧光特征。     

受激辐射损耗超分辨显微成像系统研究的新进展

由于受到衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率被限制在半个波长左右.近二十年来出现了许多通过不同方法绕过光学衍射极限的超分辨成像技术,其中,受激辐射损耗显微(stimulated emission depletion microscopy,STED)通过引入一束环形损耗光来抑制荧光光斑外围荧光分子的发光,以达到减小点扩散函数的目的,实现超分辨成像.经过近些年的发展,STED系统无论从光束的产生、校准和扫描,还是最后的成像,都有了很大的发展.本文将简要介绍STED成像技术的基本原理,详述STED超分辨成像技术出现至今在光源、扫描及成像系统等方面的进展,以及在三维成像和多色成像方面的发展现状,STED技术与其他显微技术的结合.最后,本文对STED技术近几年的研究新进展进行了系统的论述,对STED技术未来的发展趋势进行了探讨.     

用于多尺度高分辨率三维成像的双环光片荧光显微技术

本文提出了一种无衍射光片荧光显微成像技术,可以方便地对从微米到厘米各种尺寸的多种生物样本进行多尺度三维荧光成像。提出一种双环调控方法以解决传统贝塞尔光片旁瓣过重的问题,该方法能够可调节地产生0.4～5μm之间不同厚度类型的无衍射光片,同时其旁瓣占比被压低到30%以下。基于这种新的调控手段设计搭建了一套多尺度光片荧光显微成像系统。该系统展示出适用性极强的多尺度成像能力,例如：活细胞双色三维动态成像、膨胀细胞三维超分辨成像以及介观尺度下全器官的高通量三维成像。证明该多尺度成像模式能够显著提升光片荧光显微镜的成像效率,由此可以推进细胞生物学、组织病理学、神经科学等多种生物医学相关研究的发展。     

大视场结构光照明显微技术（特邀）

结构光照明显微（SIM）具有成像速度快、对样品损伤小,以及对荧光标记物和标记程序无特殊要求等优点,成为研究活细胞结构和动态过程的重要成像手段之一。介绍了一种大视场、双模式（条纹/点阵）SIM显微技术。该技术结合二维光栅投影产生条纹/点阵结构光,空间光调制器选择条纹方向和实现相移,打破传统SIM中条纹数量受数字投影设备像素个数限制的瓶颈,同时保持了传统SIM成像速度快的优势。实验结果表明：该技术在20×/0.75数值孔径物镜下可获得690μm×517μm成像视场和1.8倍空间分辨率提升,其空间带宽积是传统SIM的3倍。该技术有望被应用于生物学、化学和工业等领域。     

适于逆光条件的消鬼像镜头光学设计与实验验证

鬼像是逆光照明下影响光学镜头成像清晰度、对比度的主要原因,为减少其影响,研究典型匹兹万镜头的消鬼像问题。运用近轴矩阵光学理论,详细分析讨论匹兹万镜头的鬼像特性,给出抑制方法。根据使用要求,优化设计和研制了消鬼像光学镜头,像质评价结果表明鬼像能量低且分布均匀,具有接近衍射极限的成像性能。逆光照明下的成像结果表明,研制的镜头具有优异的鬼像抑制性能,验证了设计和分析的正确性。给出的鬼像抑制方法可用于其他光学系统。     

双色荧光辐射差分超分辨显微系统研究

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用,使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像,本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像,以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后,本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明,在488 nm和640 nm激发光下,该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率,另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像,满足了实际应用的要求。     

多变视场的多焦点多光子激发荧光显微技术

发展了一种新型的多焦点多光子激发荧光显微技术,通过软件控制空间光调制器,在所需要的成像区域产生相应的激发光点阵,通过扫描入射角实现激发点阵快速并行扫描激发,通过CCD并行记录所产生的荧光信号,获得任意视场图像。分别实现了10×10和50×50点阵激发下的全视场双光子荧光图像,并且实现了同时多个区域寻址的多焦点激发成像。对比其他多焦点显微技术,该技术具有明显的灵活性,不但保持了多焦点激发的快速成像的优点,而且还增加了任意数量成像区域同时寻址和阵列点密度变化,所有这些变化只需要通过软件加载相应的相位图案给空间光调制器,而不需要任何硬件更改。     

具有延长共轭的绿色发光蛋白生色团的反向溶剂化斯托克斯(Stokes)位移（英文）

受天然荧光蛋白启发的发色团结构在生物成像领域发挥着重要作用.本文通过计算的方法研究了一类新的绿色荧光蛋白发色团的光化学性质.首先,得到了这一类发色团在真空和溶液中热动力学稳定异构体;然后,计算了它的斯托克斯(Stokes)位移,并与实验数据进行对比.最后,观察到对于这类新的RFP生色团,它们吸收和发射波长发生了反向溶剂化偏移;通过分析,发现了导致反向溶剂化偏移的原因是在溶液中,电荷转移更加稳定,进而常见的旋转结构重组受到抑制.     

最近邻域与无邻域算法结合空间滤波实现显微光切片

运用最近邻域与无邻域算法,并结合空间滤波方法,可去除显微切层图像的离焦模糊成份,可获得高成像速度、高质量的显微光切片。对各种显微图像进行了光切片处理,并与由现有去卷积处理、结构光照明等方法获得的光切片图像进行了对比,验证了该算法在去除模糊信息方面有更好的效果,提高了图像处理效率,获得了令人满意的光切片图像。在此基础上研制出了显微光切片图像处理系统。运用最近邻与无最近邻算法,结合空间滤波方法,采用简便可调的卷积模糊算子代替点扩散函数的估计过程,图像处理方便快捷,可较好地去除离焦平面的模糊信息。