IL-24重组载体的构建及其联合化疗药物对SKOV3细胞中TUBB3与ERCC-1基因表达的影响

通过基因重组技术将白介素24(IL-24)基因片段分别克隆成pc DNA3.0-OSP-1-IL-24和pc DNA3.0-IL-24载体,利用逆转录PCR(RT-PCR)测定2种载体的表达.将2种化疗药物紫杉醇(PTX)与顺铂(DDP)分别作用于正常SKOV3细胞及pc DNA3.0,pc DNA3.0-IL-24,pc DNA3.0-OSP-1和pc DNA3.0-OSP-1-IL-24稳定转染SKOV3细胞(卵巢癌细胞株),通过噻唑蓝(MTT)法检测化疗药物联合IL-24基因对细胞的杀伤效果及细胞的增殖能力,应用实时荧光定量PCR技术检测人β-微管蛋白3(TUBB3)与核苷酸切除修复交叉互补基因位1(ERCC1)基因在各组细胞中的表达.RT-PCR检测结果显示,通过基因重组技术克隆了pc DNA3.0-IL-24与pc DNA3.0-OSP-1-IL-24载体,IL-24基因能提高SKOV3细胞对化疗药物顺铂和紫杉醇的敏感性.其联合化疗药物对肿瘤药物的IC50值分别下降了10倍和6倍,TUBB3和ERCC1基因在IL-24基因转染的SKOV3细胞内的表达水平与在正常SKOV3细胞内相比,分别下降4倍和10倍多.上述结果表明,IL-24联合化疗药物可明显下调TUBB3与ERCC1基因的表达,该实验为临床治疗卵巢癌提供了重要的理论依据.     

515例急性淋巴细胞白血病的免疫分型

用抗人白细胞分化抗原单克隆抗体对515例急性淋巴细胞白血病患者进行了免疫分型诊断,区分出T细胞型(T-ALL)和非T细胞型(Non-T-ALL)白血病,后者又分为普通型(C-ALL)、无标志型(Null-ALL)以及B细胞型(B-ALL)等主要亚型,T细胞及非T细胞型白血病细胞根据其表型特点又可进一步划分。本研究所观察到ALL细胞表型基本反映正常T或B淋巴细胞亚群分化阶段或某些类型细胞的表型特征,急性淋巴白血病免疫分型不仅有助于判断白血病细胞的来源,与FAB分型方法配合使用还可以大大提高对白血病的诊断准确率。同时,分型结果显示出与临床表现、治疗反应以及预后转归有一定的相关性。本文对中国急性淋巴患者的发病特点也进行了探讨。     

1,25(OH)_2D_3对人原始巨核白血病细胞系(HIMeg)的诱导分化研究

本文报道了生理性诱导剂1,25(OH)_2D_3对一株新建的人原始巨核白血病细胞系(HIMeg)的体外诱导分化作用。在浓度为10~(-9)—10~(-6)mol/L的1,25(OH)_2D_3作用下,活细胞计数、克隆形成率测定显示1,25(OH)_2D_3对HIMeg细胞有增殖抑制作用;同时,应用光/电子显微镜、细胞化学染色、免疫酶标、流式细胞分析等技术,从细胞形态结构、细胞化学、细胞表面分化抗原以及DNA倍体性诸方面证实了1,25(OH)_2D_3能诱导HIMeg细胞进一步分化成熟。从而提示:1,25(OH)_2D_3可能是体内巨核系的一个重要促分化因子,并可试用于治疗急性巨核细胞白血病等疾病。     

人原发性肝癌及7402细胞株和髓细胞白血病细胞株(K562)的癌基因(转化基因)的共同属性——N-ras基因

用人的原发性肝癌(PHC)、肝癌7402细胞株(郭婵等,1984)及髓细胞白血病K562细胞株的DNA转染的NIH/3T3转化株DNA,以Southern吸印和~(32)P-标记的癌基因探针做分子杂交来分析,结果如下:在PHC DNA转化的NIH/3T3细胞DNA中,鉴定有N-ras基因的7.2及9.0kb(EcoRI酶切)的带,与人白细胞和肝癌DNA中出现的专一性条带相同,但是没有人Ha-ras(BamHI 6.6kb)或Ki-ras(EcoRI 3.0kb)的专一性条带。在以7402及K562细胞株DNA转化的细胞DNA中,同时发现有人的N-ras和Ha-ras基因(6.6kb,BamHI酶切),人的Ki-ras特异片段(3.0kb,EcoRI酶切)没有被检测到。PHC的DNA中N-ras基因在带型及杂交强度上没有大的改变,由于N-ras基因(非Ki-ras,Ha-ras)的表达,在多数PHC中明显地增加,提示了N-ras至少是人肝癌的转化基因之一。     

一种αⅠ型干扰素基因新变种的发现和鉴定

本文从一名中国汉族正常人胎肝细胞染色体DNA中,应用PCR方法两次获得长为520 bp的人α型干扰素基因,核苷酸序列测定表明,两次扩增产物的DNA序列完全相同,与过去分离克隆的IFN-αI和IFN-αD基因相比较,其第410位和第541位核苷酸分别为C和G,由此推测它编码的IFN成熟肽第114位和第158位氨基酸应为Ala和Val,其余位点则与IFN-αD和IFN-αI完全相同.我们建议将IFN—αD,IFN—αI和我们分离的IFN-αI/158V基因分别命名为IFN-αIa,IFN-αIb和IFN-alc基因.     

基因分析在急性白血病分型中应用的基础研究

本文应用分子杂交技术,从DNA和RNA水平探讨了一些细胞谱性相关基因在急性白血病分型中应用的可能性及意义。研究系统分析了免疫球蛋白重链(JH)和T细胞抗原受体β链(Tβ)基因重排以及Tβ,CD_3ε和髓过氧化物酶(MPO)基因mRNA产物与各型急性白血病的相互关系。结果表明,上述各基因的重排或表达均是和急性白血病细胞谱系相关的早期标志。将基因分析应用于临床急性白血病分型将可弥补现有分型手段的不足,提高急性白血病分型的精确性。     

人肿瘤坏死因子(TNF)cDNA的分离、鉴定及其表达

PMA诱导的HL-60细胞株mRNA经逆转录合成cDNA;经过第一链cDNA为模板的PCR扩增反应,分离到一特异的615bp DNA片段。Southern杂交和DNA序列分析证实这一615bp片段包含了编码人TNF成熟肽所需的全部cDNA顺序。将这一人TNF cDNA克隆到大肠杆菌表达载体pKK223-3,获得人TNF直接表达质粒pHT-1。IPTG诱导的表达产物具有L-929细胞毒活性;并经抗体中和实验确证为人TNF。在A_(600)=2时,大肠杆菌产生的重组人TNF含量约为8×10~7U/1培养液。     

人X染色体单拷贝序列的分离及鉴定的研究

本研究以人/鼠(CHO-K1)细胞总DNA为探针对人X染色体DNA文库进行了3轮筛选,单拷贝顺序的检出率为1.45％。其中DXFD52,71,73,75分别与一组含人X染色体及不含人X染色体的人/鼠杂种细胞DNA进行Southern杂交分析,确定DXFD52,71,73,75含人X染色体专性DNA顺序。采用染色体原位杂交的方法,将DXFD52精确定位于Xq12-q13。并对其进行了部分DNA顺序分析,结果证实DXFD52是人基因组中至今未被分离到的一个单拷贝DNA片段。继而对DXFD52进行限制性酶切图谱分析,并以其为探针在中国重庆地区正常人群中(随机个体38例、3个正常家系成员11例)进行了RFLP研究,发现该探针具有识别Hind Ⅲ,Bgl Ⅱ,Hinf Ⅰ的RFLP。     

双Schiff-Base取代的3,5-二(芳亚甲基)-4-哌啶酮衍生物的合成及活性研究

通过Claisen-Schmidt缩合、Sn Cl2/HCl还原和Schiff-Base缩合反应得到9个双Schiff-Base取代的3,5-二(芳亚甲基)-4-哌啶酮衍生物(3a-i),并通过核磁共振(NMR)、傅立叶变换红外光谱(FTIR)、元素分析进行结构表征,采用MTT法,评价其对SGC-7901(胃癌细胞)、A549(肺癌细胞)、HCT116(结肠癌)、He La(宫颈癌细胞)、He PG2(肝癌细胞)、K562(人慢性骨髓性白血病细胞)、THP-1(人急性单核粒细胞白血病细胞)、U937(组织细胞淋巴瘤细胞)、MCF-7(乳腺癌细胞)等细胞系的抗肿瘤活性以及对LO2(人正常肝细胞)的细胞毒性。结果显示,部分化合物对某些细胞的IC50值小于1.0μmol/L。细胞毒性实验显示,化合物3a,d-f对正常细胞LO2的细胞毒性比阿霉素(DOX)小。构效关系显示F取代的化合物3a-c活性优于Br和Cl取代的化合物3d-i。通过PCR、Western Blot以及分子对接模型初步说明3b和3i对Bcl-2蛋白有显著的抑制作用。     

PEG化壳聚糖/DNA自组装复合物的制备、表征和体外Hela细胞转染研究

通过有机合成和高分子聚合等方法将亲水性的聚乙二醇接枝到壳聚糖的氨基侧链上，得到了改性的壳聚糖—聚乙二醇接枝共聚物，应用现代波谱等技术对中间产物和最终产物进行了表征，采用绿色荧光蛋白基因质粒pEGFP—N1为DNA模型，在溶液中通过自动(静电)吸附得到PEG化的壳聚糖／DNA自组装复合物，初步研究了该自组装复合物对Hela细胞的体外转染效率。结果表明，活化的聚乙二醇被成功地接枝到壳聚糖上，使不溶于水的壳聚糖改性为水溶性的PEG化的壳聚糖。PEG化壳聚糖／DNA自组装复合物在Hela细胞体外转染率达到81％。因此，PEG化的壳聚糖有可能成为基因转染的非病毒载体。     

中国人ω1型干扰素基因的克隆、一级结构测定以及在大肠杆菌中的表达

采用聚合酶链反应(PCR)方法,从中国正常胎儿肝细胞染色体DNA中分离并克隆了人ω1型干扰素基因,测定了核苷酸全序列,表明原有争议的第88位密码子为GGA的核苷酸序列是正确的,因此该氨基酸为Gly。随后又利用PCR技术将所获的ω1型干扰素基因原始克隆改造成适于在大肠杆菌中表达非融合蛋白的结构形式,并以pBV220为载体在P_RP_L串联启动子控制下进行温控表达。表达产物的抗病毒活性达6.5×10~7单位/升菌液(O. D_600=0.75)。IFN-ω1不仅具有很高的抗病毒活性,同时在结构上与动物滋养层蛋白高度相似,而后者又是作为母体妊娠识别信号存在于多种动物体内的抗黄体退化蛋白,因此本文获得的这—ω1型干扰素基因及重组蛋白在理论和实际上都有进一步研究的价值。     

微流控芯片实验室在基因分析研究中的应用

对微流控芯片实验室在基因分析中应用研究的最新进展予以综述,特别注意到了这种新技术平台在不同类型的基因多态性检测和脱氧核糖核酸(DNA)测序中的贡献,在一定程度上反映了这种贡献在临床诊断、法医学鉴定等领域已经产生的影响。     

急性早幼粒细胞白血病(APL)15号染色体断裂点的分子生物学研究

本文克隆了1例APL患者的染色体断裂点,发现位于17号染色体的维甲酸受体α(RARA)基因与15号染色体上一个被命名为早幼粒细胞白血病(PML)的转录单位发生融合,继而克隆并定序该基因的部分区域,并分离一组分子探针,在36例APL患者中检测出33例有PML基因重组,其中24例的15号染色体断裂点丛集于一个4.4kb的区域,称为PML~(ba-1),9例的断裂点位于PML~(ba-1)上游一个6.5kb的区域,称为PML~(ba-2),这两种不同分子重排是形成PML-RARA融合基因异质性的主要原因,其可能的生物学意义有待进一步研究。     

中国人促红细胞生成素基因组的克隆及其在COS-7细胞中的表达

本文利用PCR技术,从正常人胎肝染色体DNA库中分离克隆了长度分别为506bp,465bp的中国人促红细胞生成素(EPO)基因组片段。506bp基因片段包括外显子2(信号肽),内含子2和外显子3;465bp片段包括外显子4,内含子4和外显子5。通过在引物中设置的酶切位点将两个克隆片段进行了正确的拼接,从而得到了约1.0kb的EPO次全基因组片段,它包括除信号肽中第2,3,4位氨基酸外的所有编码区及两个内含子序列。 所克隆的次全EPO基因组插入表达载体pSV2-dhfr中的不同克隆位点,构建了3种不同的转移载体质粒,分别转染导入COS-7细胞后,3种转移载体质粒转染的细胞上清液都有明显的EPO活性。本工作证明仅含有内含子2,4序列,去除负调控区和氧敏感区序列的人次全EPO基因组可以在COS-7细胞中获得表达。     

具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含硒人源单链抗体的制备

以谷胱甘肽(GSH)为靶抗原, 从噬菌体展示人源单链抗体库中筛选人源单链抗体(scFv). 经3轮筛选后, 用ELISA方法检测出5个(2, 11, 16, 24, 32 )可以和GSH结合的克隆. PCR产物的电泳和测序结果表明, 只有3个克隆(11, 16, 24)具有完整的scFv编码基因. 选取和GSH结合力高的克隆11的scFv 编码基因组装到表达载体pPELB上, 在大肠杆菌Rosetta中进行可溶性表达, 用Ni2+螯合亲和层析纯化scFv-11, 免疫点印迹结果证实该抗体能与GSH特异结合. 通过化学突变将scFv-11的丝氨酸转变成硒代半胱氨酸(Sec)后, 获得了具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力的含硒(Se)人源单链抗体(Se-scFv-11), 其活力为351 U/μmol.     

半合成人肿瘤坏死因子cDNA的构建及其在大肠杆菌中的高表达

本文报道从人基因文库中分离淋巴毒素(LT)基因的同时,克隆了肿瘤坏死因子(TNF)基因,这两个基因相距1.2kb.TNF基因有4个外显子,第4外显子编码TNF成熟蛋白157个氨基酸中的140个.将第4外显子切出一部分,再人工合成编码其余氨基酸的DNA片段,两者连接构成重组的人TNF(rhTNF)cDNA,并克隆在大肠杆菌表达载体中成功地得到表达.5 l罐发酵得菌体约20g/l,以L929为靶细胞测定细胞毒活性为10~6-10~7单位/ml.高压液相色谱仪分离纯化rhTNF,冻干后得白色粉剂.测定了这种rhTNF的氨基端的10个氨基酸序列,证明与天然的人TNF完全相同.纯度约为95％.     

胞质因子对人早幼粒白血病细胞恶性表型和基因表达的调控作用

本文利用胞质杂交的细胞工程手段,研究人早幼粒白血病细胞突变株在添加小鼠网织红细胞胞质后的细胞恶性表型表达状态。实验结果表明,HGPRT~-人早幼粒白血病细胞突交株(HL-60-AR)与小鼠网织红细胞融合所形成的胞质杂交细胞,其恶性程度较亲本瘤细胞显著降低,它们在体外软琼脂培养基上不能形成集落,在裸鼠体内丧失致瘤能力,同时细胞增殖率降低,细胞分裂指数下降,DNA合成速率减慢。利用c-myc癌基因探针的分子杂交技术,未检测到胞质杂交细胞存在相当于c-myc基因特异的同源序列mRNA,提示杂交细胞癌基因表达严重受抑。对杂交细胞珠蛋白在翻译和转录水平上的表达分别进行探测,结果一致显示胞质杂交细胞中人珠蛋白基因受到激活。上述结果提示,小鼠网织红细胞中存在能调控人肿瘤细胞恶性表型和基因表达状态的胞质因子。     

基于克隆测序技术的人类白细胞抗原基因高分辨率分型方法的建立

运用优化的扩增和克隆测序技术,建立了人类白细胞抗原( HLA-B)基因的高分辨率分型方法。针对HLA-B基因保守区序列设计引物进行等位基因扩增,基于质粒不相容原理将杂合型等位基因有效克隆入质粒DNA中,经细菌培养后进行Sanger测序,根据测序结果经ClustalX2软件分析和IMTG/HLA数据库的BLAST比对即可完成HLA-B基因的高分辨率分型。利用建立的方法对7例临床样本进行了HLA-B基因分型,并且与第三方直接碱基序列分析基因分型技术( PCR-SBT)进行比对,结果完全一致。本方法无需专业分型软件,准确度高,成本低;采用通用引物进行等位基因的扩增和测序,无需传统方法中繁琐的引物设计和过程优化,实现了HLA-B基因的高分辨率分型。     

毛细管电泳在完整哺乳动物细胞分析中的应用

作为人体形态结构、生理功能和生长发育的基本单位,细胞的结构功能及行为分析具有重要的研究价值。毛细管电泳作为日渐成熟的微量分析技术在细胞分析及应用方面已取得显著进展。本文综述了毛细管电泳在完整哺乳动物细胞分析中的应用,包括群体细胞分析和完整单细胞分析。所述内容涉及血红细胞、公猪精子、人宫颈癌细胞、人神经母细胞瘤细胞、人结直肠腺癌细胞、人慢性髓系白血病细胞以及鼠小脑颗粒细胞。总结了完整哺乳动物细胞分析的毛细管电泳方法和条件,归纳分析了完整细胞分析中存在的细胞破碎、聚集、沉降、吸附及电泳异质性等关键问题及解决方法。对毛细管电泳在细胞分析方面未来的应用方向进行了展望。综述文献49篇。     

水稻腊质基因分子特性的研究

水稻腊质基因(Wx)负责胚乳与花粉粒中直链淀粉的合成。我们通过对限制图和DNA顺序有重叠的两个基因组克隆的分析,测定出了水稻Wx基因全长为5499bp的DNA顺序。比较水稻、玉米(Klsgen等)和大麦(Rohde等)中Wx基因的DNA顺序,弄清水稻Wx基因中存在13个内含子和14个外显子,通过微机对外显子顺序的翻译,得出了水稻Wx蛋白包括转运肽在内的609个氨基酸的排列顺序,并计算出它的分子量约为72kD。经比较,水稻Wx成熟蛋白的氨基酸顺序与玉米、大麦的没有明显地差异。但是,水稻Wx基因5′-上游区、3′-下游区和内含子区域的DNA顺序,以及Wx前体蛋白的转运肽区域的氨基酸顺序与玉米和大麦Wx基因的相应区域相比,它们之间的同源性却很低。